定量PCR标准化，挑战在哪里？

　　六年前，科学家针对实时定量PCR实验中的种种问题，提出了一套统一的评估标准——MIQE指南。两年前，数字PCR版本的MIQE指南也出炉。然而，认真执行MIQE指南的实验室并不多。定量PCR标准化，挑战在哪里？Jeffrey Perkel博士近日在《BioTechniques》上讨论了这一问题。

　　当零基础的人们准备开展定量PCR时，大多会请教师兄师姐。不过，对于数字PCR（dPCR）这种比较新的技术，周围的人未必有经验。同时，这种技术不像传统PCR那么简单，需要用到专门的仪器、操作和变量。Perkel认为，若未经培训的研究人员利用dPCR来定量mRNA的丰度，他们也能获得一个数字，但这个数字是否能准确代表样品本身，就不好说了。

　　幸运的是，一组研究人员已经开发出dPCR实验的路线图，称为digital MIQE指南。这个指南能够指导研究人员开展dPCR，包括实验设计和分析。digital MIQE论文的主要作者，LGC公司的首席科学家Jim Huggett表示：“digital MIQE是关于你论文中所包含的信息，这让我能够重复你的工作。”

　　然而，尽管越来越多的研究人员在实验中使用dPCR，但采用digital MIQE指南的仍是少数。根据Google Scholar的统计，digital MIQE指南自2013年发表以来被引用74次，而同期发表的dPCR文章超过400篇。同样，原先的MIQE指南自2009年以来被引用3200次，而qPCR文章超过26,000篇。

　　这与Nature Methods早期的一项调查一致，说明十篇文章中约有九篇未能提供最低要求的实验数据，因而有可能包含误导的结果和结论。那么，研究人员为什么会忽视MIQE指南？罗格斯大学的Andrzej Pietrzykowski认为，许多人并不知道MIQE，而有些人认为采用MIQE指南会带来额外的工作，也要花费更多的钱。

　　对于这种现状，digital MIQE论文的资深作者、英国安格利亚鲁斯金大学的Stephen Bustin教授认为，MIQE指南的执行需要期刊编辑的参与。尽管在过去几年数据重复性的问题引起广泛讨论，但Bustin及其同事发现，MIQE采用率与期刊的影响因子成反比。

　　不过，Bustin教授也表示，仪器供应商已成为MIQE指南的积极推动者。尽管还没有MIQE认证的仪器或试剂盒，但许多供应商都在向他们的客户推广MIQE指南。例如，Bio-Rad已推出了一个移动app，能实时量化是否符合MIQE。

　　这些工具可以使研究人员更清楚了解PCR的良好实践。不过，Huggett认为MIQE可能还面临观念的问题。有些人认为这像是专政。Huggett指出，这并不是一套规则，而是建议，其目的是帮助研究人员充分利用他们所有的，以便让每个反应都有价值。