实时荧光定量PCR结果分析，教你从菜鸟到高手

　　实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

　　在对荧光定量PCR结果进行分析时首先要了解几个概念：

　　基线（Baseline）指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。

　　光域值threshold的设定，一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

　　CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。

　　融解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，融解曲线就会出现一尖峰；如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个尖峰。

　　Real-Time qPCR 常见问题分析

　　1.无Ct值出现

　　1）检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法

　　则一般在退火结束时或延伸结束采集信号；

　　2）引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

　　3）模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；

　　4）模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

　　2.Ct 值出现过晚（Ct>38）

　　1）扩增效率低:反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；

　　2）PCR各种反应成分的降解或加样量不足，

　　3）PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。

　　3.标准曲线线性关系不佳

　　1）加样存在误差：使得标准品不呈梯度；

　　2）标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；

　　3）引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；

　　4）模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

　　4.负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰

　　1）引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；

　　2）引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

　　3）镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒；

　　4）模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

　　5.扩增效率低

　　1）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；

　　2）反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；

　　3）反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板

　　适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

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