实时荧光定量PCR（realtimePCR）

实验步骤

一、 样品RNA的抽提 

1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

3.  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。

5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、 RNA质量检测 

1.  紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

 （1）浓度测定

A₂₆₀下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A₂₆₀ ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀释至495 μl的TE中，测得A₂₆₀ = 0.21

RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定

（1）制胶

1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度  成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸钠

0.01 M  EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

（2）准备RNA样品

取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

（3）电泳

上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。

（4）紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

三、样品cDNA合成 

1.  反应体系

序号          反应物           剂量

1          逆转录buffer       2 μl

2         上游引物              0.2 μl

3         下游引物              0.2 μl

4          dNTP                   0.1 μl

5       逆转录酶MMLV     0.5 μl

6         DEPC水              5 μl

7          RNA模版            2 μl

8           总体积               10 μl

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

2.  混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。

3.  取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR 

1.  β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为10¹¹，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 μl并充分混匀）为10¹⁰，依次稀释至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴，以备用。

2.  反应体系如下：

标准品反应体系

序号           反应物                           剂量

1       SYBR Green 1 染料             10 μl

2       阳性模板上游引物F              0.5 μl

3      阳性模板下游引物R              0.5 μl

4                 dNTP                            0.5 μl

5                 Taq酶                           1 μl

6           阳性模板DNA                    5 μl

7              ddH₂O                            32.5 μl

8               总体积                            50 μl

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

3.  管家基因反应体系：

序号            反应物                                剂量

1      SYBR Green 1 染料                   10 μl

2      内参照上游引物F                         0.5 μl

3     内参照下游引物R                         0.5 μl

4               dNTP                                    0.5 μl

5               Taq酶                                   1 μl

6      待测样品cDNA                             5 μl

7              ddH₂O                                  32.5 μl

8             总体积                                    50 μl

轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。

3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 

1.  针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

2.  反应体系

序号                     反应物                        剂量

1                     10× PCR缓冲液            2.5 ul

2                           MgCl2 溶液              1.5 ul

3                           上游引物F                 0.5 ul

4                           下游引物R                0.5 ul

5                            dNTP混合液            3 ul

6                            Taq聚合酶               1 ul

7                             cDNA                       1 ul

8                    加水至总体积为               25 ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。

（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×10¹⁰，依次稀释至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴几个浓度梯度。

六、 待测样品的待测基因实时定量PCR 

1.  所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

2.  体系配置如下：

序号             反应物                                剂量

1            SYBR Green 1 染料               10 ul

2                上游引物                               1 ul

3                下游引物                               1 ul

4                  dNTP                                   1 ul

5              Taq聚合酶                               2 ul

6             待测样品cDNA                        5 ul

7                   ddH2O                              30 ul

8                   总体积                               50 ul

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，zui后72℃7分钟延伸。

七、 实时定量PCR使用引物列表 

引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与