实验技术：细胞培养基本技术

一、操作规程：

1.实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌,用70％酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染.实验结束后,将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验,则用70％酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作。

2.无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通.实验用品要用70％酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。

3.小心取出无菌实验用品,避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。

4.工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐物品伤人等。

5.定期检查下列项目：CO₂钢瓶内的CO₂压力；CO₂培养箱内的CO₂浓度,温度,及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜,预滤网（300小时/预滤网,3000小/HEPA)。

二、粉末细胞培养基的配制(以1 升为例)：

细胞培养基通常须添加10％血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO₃另外添加，若将NaHCO₃ 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO₃ 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO₂ 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。

【试剂与设备】

1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)

2. 粉末培养基 （1640、DMEM等）

3. NaHCO₃ (Sigma S-4019)

4. 电磁搅拌器

5. 无菌血清瓶

6. 0.22 微米无菌过滤膜

7. pH meter

8. 真空瓣

9. CO₂ 气体

【配制步骤】

1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。

2. 称取适量之NaHCO₃粉末(数量依培养基种类而异)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO₂气体至饱和，约3-5 分钟。

3. 将溶解且含饱和CO₂ 之NaHCO₃ 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO₂ 气体调整pH。培养基以真空帮助通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。

4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃ (血清亦可加入培养基中一起过滤)。

5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

【注意事项】

1. 液体培养基贮存于4 ℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。

2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。