实验相关技术|PCR方法简介

　　PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时间内扩增物十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。PCR法是目前基因诊断中使用最多的方法。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。PCR技术自诞生之日起就决定了它不仅是一种检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行定量分析的有力工具。

　　PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　　一、所需试剂

　　1. DNA模版

　　2．与DNA结合的特异引物

　　3．10×PCR Buffer

　　4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

　　5．Taq酶

　　二、操作步骤

　　1. 在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

　　10×PCR buffer 5μl； dNTP mix（2mM） 4μl；引物1（10pM） 2μl； 引物2（10pM） 2μl；Taq酶（2U/μl）1μl；DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μ；视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

　　2. 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。 一般：在93℃预变性3-5min以激活DNA酶，进入循环扩增阶段破坏DNA双链间的氢键使其变为DNA单链，并与引物结合：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。

　　DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。

　　3. 待反应结束，PCR产物放置于4-10℃待电泳检测或-20℃长期保存。