小白鼠骨髓细胞染色体制片技术

实验概要

1、掌握哺乳动物骨髓细胞染色体玻片标本的制备方法。
 

2、观察动物染色体的形态特征，统计小白鼠体细胞中染色体数目。

实验原理

制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。
 

制备动物染色体标本原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中获得。

小型动物的染色体制片最好最有效的材料是骨髓组织，且程序简便。另外，在骨髓细胞中，有丝分裂的指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。中期分裂相主要来自成红系统，也来自其它各种骨髓母细胞，单核细胞和淋巴细胞的分裂相较少，不过在染色体制片上已无法区别上述来源。多倍体的中期分裂相往往来自于巨核细胞。
 

对大型动物通常采用对股骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。通过骨髓得到的染色体是比较简便的，一般无须无菌操作，在临床上多用于白血病的研究。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。
 

不过，在有些情况下，穿刺取骨髓较困难，或者希望对同一个体材料进行连续的对比取材，以观察药物或环境因素对人类或动物的影响及染色体的动态变化，这时一般采用外周血细胞而不伤害供血者直接制备染色体的技术则十分有利。

主要试剂

秋水仙素、固定液（甲醇:冰醋酸 = 3:1）、Giemsa染液、磷酸缓冲液（pH6.8）等。

主要设备

解剖器具（刀、镊等）、注射器（1ml）、离心机、水浴锅、显微镜、吸管等。

实验材料

两个月龄的健康小白鼠（Mus musculus）。

实验步骤

1、预处理：实验前3—4小时，取健康小鼠，每只腹腔注射0.01%秋水仙素0.3—0.4ml。注意不要伤及内脏。

2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠的头部，另一只手拉住它的尾巴，用力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪刀剪开后腿上的皮毛，取出小鼠的股骨，剔除上面的肌肉，洗净。

3、取骨髓细胞：将股骨纵向剪开，剔除深红色的骨髓，放至装有蒸馏水的小烧杯中。用剪刀把骨髓剪碎，至残渣变白，把上清液倒入离心管中。

4、低渗处理：将离心管中的液体用蒸馏水补充到刻度，然后置于37℃的恒温水浴锅内保温30分钟。

5、离心固定：将离心管放入离心机内，平衡后，以1000转 / 分的转速离心10分钟，然后用吸管移去上清，加甲醇-冰醋酸的固定液至刻度，固定30分钟，如前，同速度同时间离心一次，弃去上清，留约0.2ml，将沉淀轻轻吹起成细胞悬液。

6、滴片：用镊子从冰水中取出预冷的载玻片，甩掉上面的冰水后迅速用吸管吸取细胞悬液滴在载玻片上2—3滴（滴片的高度30—50cm），立即用嘴向同一方向吹，使细胞染色体散开，然后置室温下干燥或置于酒精灯火焰上微微加热干燥。每人做两张滴片，注意平均分配细胞悬液。

7、染色：取一张干燥的滴片放入装有1%Giemsa染液的染色缸中染色30分钟，另一张不染，留下次实验用，染色完毕，用自来水冲洗后干燥。

8、镜检：将制备好的玻片标本置于显微镜下，首先用低倍镜寻找细胞和中期分裂相，然后换用中高倍镜观察染色体的形态，统计染色体的数目。