小规模快速制备果蝇RNA

Northern 样品缓冲液  lmol L 乙酸   酚 氯仿  DEPC 处理的水 GHCL 溶液   无水乙醇

一 材料与设备

1)Northern 样品缓冲液：2.2mol/L 甲醛，1mol/LMOPS，50% 甲酰胺

2)lmol/L 乙酸

3) 酚：氯仿（1:1)

4)DEPC 处理的水

5)GHCL 溶液：5mol/LDTT，7.5mol/L 盐酸胍，25 mmol/L 乙酸钠 (pH7.0)
0.5%N-月桂肌氨酸

6) 无水乙醇


二 操作方法

1) 把果蝇或果蝇胚胎放入装有 GHCL 溶液的 1.5 ml 离心管屮每只果蝇或 50〜100 个果蝇胚胎需 50ulGHCL 溶液，最多处理 20 只果蝇

2) 用小研杵快速匀浆样品

3) 匀浆液中加入等体积的酚：氯仿，振摇混合
.
4) 在微量离心机中以最大转速离心 2 min

5) 上层水相转移到一个新的小离心管中

6) 每 50ulGHCL 溶液加入 lmol/L 的乙酸和 25ul 无水乙醇，以沉淀 RNA

7) 于-20℃ 放置 3〜24 h。

8) 在微最离心机中以最大转速离心 5 min

9）小心去掉上清，再以最初所用的一半体积的 GHCL 溶液溶解沉淀最小体积为 (50ul),

10) 按第至第 9) 步的方法重新沉淀 RNA。

11) 若有必要，再按上述方法沉淀 RNA—次。

12) 在 RNA 沉淀中加入第一步所用的 GHCL 溶液体积的无水乙醇，混合。

13) 用微量离心机以最大转速离心 15mim。

14) 去掉乙醇，如有必要再用无水乙醇再洗一遍。

15)RNA 沉淀可在合适的缓冲液或无水乙醇屮保存。如果 RNA 用来作 Northern 印迹分析，最好用 Northern 样品缓冲液溶解。

1) 如果需要非常纯净的 RNA，按第 6) 至第 9) 步的方法共沉淀 RNA 三次

2) 为了最大限度的降低 RNA 酶的作用，操作时要戴手套，并经常更换，所有溶液都需用 DEPC 处理过的水配制。