实验步骤：
（1）诱导靶蛋白表达
分别挑取对照菌和重组菌1~2个菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。
取5ml过夜培养物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A550=0.5~1.0）。
向诱导管中加入IPTG使其浓度达到1mmol/L，28℃振荡培养5h左右取样。
（2）目的蛋白质的分离纯化
样品处理
① 取500ml诱导的培养液，12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。菌体在-20℃（最好在用液氮或干冰）反复冻融几次，使菌体裂解后呈现黏液状。
② 用针筒将20ml含0.2% Triton X-100和1mmol/L
PMSF的PBS强行注入黏的细胞裂解液中，剧烈混匀。加入DNase和RNase至终浓度达5µg/ml，4℃振荡温育10min，4℃
8000RPM离心出去不溶物，上清液转移至一新管中，加β-巯基乙醇（或DTT）至终浓度为1mmol/L。
上清液需用0.45µm滤膜过滤，以防止堵塞柱子。Triton X-100可防止蛋白聚集，DTT或β-巯基乙醇可使GST保持还原状态。
蛋白纯化
① 在注射器（或恒流泵的导管）中充满结合缓冲液，排除气泡。打开亲和柱出口，连接注射器和柱子，以10个柱床体积的结合缓冲液（PBS）平衡柱子，流速控制在1ml/min。
② 用注射器上样，流速控制在0.2～1ml/min，上样量约为2个柱床体积。
③ 用5～10个柱床体积的PBS洗脱未结合蛋白，流速1ml/min（或检测没有蛋白流出为止）。
④ 用2个柱床体积的洗脱缓冲液目的蛋白，流速1ml/min，在洗脱流出液达到0.5ml后开始收集目的蛋白。
⑤ 结合力低的柱子可用2个柱床体积2M的盐酸胍洗柱子后，立即用5个柱床体积的结合缓冲液洗柱子，以达到再生的目的。
⑥柱子储存在4℃下的20％乙醇中。
Western Blotting
实验目的：掌握Western Blotting的操作流程和通过Western Blotting鉴定目的蛋白的方法
实验原理：
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.其分离原理是根据蛋白质的分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT)，其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构，SDS
是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，电泳样品假如样品缓冲液后，要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时，蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化，蛋白质也完全变性和解聚，并形成榛状结构，稳定的存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基，然后根据抗原－抗体结合原理及显影技术就可以确定表达的蛋白是否为目的蛋白
实验步骤：
(1) 电泳
① 准备步骤
将凝胶板水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。梳子临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在灌胶架上。
按下表配制适合浓度的分离胶，摇匀后迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，小心在胶上覆盖一层95%的乙醇。
| 10%(ml) | |
| H2O | 4.10 |
| 29%Acr+1%Bis | 3.34 |
| 4×分离胶缓冲液(pH8.8) | 2.50 |
| 10% SDS | 0.05 |
| TEMED | 0.02 |
| 10%过硫酸铵 | 0.02 |
| 总体积 | 10ml |
在分离胶聚合的过程（约30min）中，按下表配制5%的浓缩胶，注意TEMED应在灌胶前才加入。
| H2O 3.675（ml） 29%Acr+1%Bis 0.65 8×浓缩胶缓冲液(pH6.8) 0.625 10% SDS 0.05 TEMED 0.05 10%过硫酸铵 0.05 总体积 5ml |
分离胶聚合完全后，倒去乙醇，用滤纸吸干胶面上的残余水。
灌注浓缩胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。
浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。将胶板固定于电泳槽上，上下槽各加入电极缓冲液。
② 上样
将实验11获得的蛋白溶液按1：1比例加入2×SDS上样缓冲液混合，100℃沸水浴10min。10000rpm离心1min，置冰上用上清液来点样电泳。
用微量进样器加样，每个点样孔中加入20µl样品，同时点蛋白marker。每次应洗涤加样器，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。
③ 电泳
装好冷凝水系统，打开电源，电压为100V，电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。
④ 染色：从电泳装置上卸下胶板，小心橇开玻板取出凝胶，将胶板放入考马斯亮蓝R250染色液中染色2h以上。
⑤ 脱色：移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。根据电泳结果分析诱导菌株有无表达目的基因。
(2) 杂交
① 将电泳后的胶板取出，裁取和胶等大的硝酸纤维素膜，按照：海绵-滤纸-胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序装入电转印槽中，注意硝酸纤维素膜一定要朝向正极一侧。
② 加入转膜缓冲液，放在冰水浴中60V电压（150mA）转印2h。（整个过程应带手套操作）
③取出硝酸纤维素膜用TBS冲洗一次。室温下，在脱色摇床上用含10%脱脂奶粉的TBS封闭硝酸纤维素膜1h。倒掉封闭液，用TTBS(含0.1%的吐温-20)洗膜10min。
④取1μl
anti-GST单克隆抗体（一抗），稀释在500μl含少量脱脂奶粉（2%的奶粉）的TTBS（含吐温-20，0.05%）中，将稀释的一抗均匀点在一干净的塑料膜（长和宽大约分别是膜的2.5倍和1.5倍）上，要求点一抗的面积同硝酸纤维素膜等大。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在一抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。25℃放置2h（或4℃过夜）。
⑤ 用TBS洗膜2次，用TTBS（含吐温-20，0.05%）洗1次，每次需持续约10min。
⑥ 取1μl
goat-anti-mouse-IgG-HRP（二抗），稀释在500μl含2%的奶粉的TTBS（含吐温-20，0.05%）中，同样，将稀释的二抗均匀点在一干净的塑料膜上。小心地将硝酸纤维素膜有蛋白一侧铺在二抗上，注意排除气泡，同时保持湿度。25℃放置1h。
⑦ TTBS（含吐温-20，0.05%）洗膜4~5次，每次5min，将硝酸纤维素膜装入杂交袋中，
⑧ 在EP管中按1ml BAD增强剂兑50µl DAB配制显色液，配好的显色液避光保存，30min内有效。
⑨在杂交袋中加入显色液，室温下显色2～30min，当有清晰的棕褐色条带出现时，用水冲洗硝酸纤维素膜终止反应，观察并分析结果，干燥保存。