小鼠肝细胞原代培养实验

将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 

小鼠

DMEM 无血清DMEM培养基 胰酶 PBS

饭盒 纱布 剪子 镊子 烧杯 平皿 研磨玻片 滤网 离心管 6孔培养板 吸管 移液管 手套 微量加样器

1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3. 用手术剪将脏器剪成小块（大小约1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心（1 000 rpm，5 min）。

4. 视组织或细胞量加入5-6倍（3-5 ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7. 再次离心5 min，弃上清液。

8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9. 加入含血清的培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10.  将细胞调整到5×10⁵/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。

2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。

4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。

5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。

8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。