小鼠腹腔巨噬细胞培养实验

小鼠

1640 培养基 小牛血清 双抗 台盼兰

手术器械 一次性注射器 眼科镊 眼科剪 96 孔板 CO2培养箱

一、实验步骤

1. 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

2. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2 分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。

3. 用注射器抽取5mL 含双抗的RPMI 1640 培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。

4. 1000 rpm 离心5 min 后，用含双抗的RPMI 1640 培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

5. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x10⁵个/mL，接种到96 孔板中，每孔100-200μL；如 果作为其它实验使用，可以调整成2x10⁶/mL，加到 24 孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO₂温箱孵育2 h 后， 换液，并用RPMI 1640 培养基洗1-2 次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

二、结果
 

巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40 倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

1. 严格无菌操作，在超净台内进行；

2. 为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器；

3. 吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。 

巨噬细胞一般没有特殊的鉴定方法，有两条经验：

1. 巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖

2. 很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。