小鼠角质细胞的分离和培养

实验步骤                                                         1) 将 1~2 天龄新生裸鼠窒息后，置于培养皿中，用 1% 碘聚乙烯吡咯烷酮液洗净裸鼠, 流水彻底冲洗，然后用 70% 乙醇洗两次。

2) 上除小鼠的四肢和尾巴。

3) 将小鼠从尾巴至鼻子的皮肤作一简单切口，用大鼠牙齿镊轻轻将整个身体的皮肤剥下，用一把镊子夹住身体，另一把镊子拉开皮肤。

4) 将剥下的皮肤组织置于放在冰上的无菌培养皿表面，直至所有的皮肤收集完毕。

5) 用 2 把大鼠牙齿钳夹住皮肤组织，在含 2.5% 胰蛋内酶的 HBSS 无菌培养皿中漂洗皮肤组织（真皮组织在下），然后置 4℃过夜。表皮不应淹没在胰蛋白酶液中。

HBSS

NaCl                            8 g/L

KCl                              400 mg/L

KH₂PO₄                     60 mg/L

无水 Na₂ HPO₄        47.86 mg/L

无水葡萄糖               1000 mg/L

NaHCO₃                   350 mg/L

6) 从胰蛋白酶处理液中取出组织，将表皮面朝下置于干燥的无菌细胞培养皿表面。

7) 用剪刀小心地将表皮残留物剪碎，置于含「常规」培养液（MEM 含 10%FCS,100IU/ml 青霉素，100ug/ml 链霉素，2~4 mmol/L L-谷氨酰胺；每 5 只小鼠皮肤用10 ml) 的无菌烧瓶中，磁力搅拌器 37℃剧烈搅拌 45 分钟。

8) 用 4 层无菌 Nitex 纱布（16xx 孔，Martin 提供）过滤液体。

当其他细胞通过时角质层细胞留在纱布的表面。

9) 用培养液将细胞洗下，培养基的用量约为一块皮肤 10 ml, 将细胞接种于塑料细胞培养瓶中或玻璃盖玻片上，37℃ 培养 4~12 小时。

也可将细胞离心后收集沉淀（800 g，10 分钟），用含 10%DMSO 的培养液再悬细胞，冻存下于液氮中以备用。

10)4~12 小时后观察培养皿表面的细胞群。

11) 将细胞转移至低钙培养液，角质细胞将开始繁殖。