小鼠诱导性多能干细胞诱导及建系

实验概要

小鼠诱导性多能干细胞诱导及建系

主要试剂

0.05%Trypsin、0.25% Trypsin、0.1%明胶、细胞基础培养液、DPBS、冻存液A、iPSCs诱导培养液

实验材料

35 mm、60 mm、100 mm培养皿，15 mL、50 mL离心管、体视镜

实验步骤

①每隔24 h为感染后的细胞换液，继续用细胞基础培养液进行培养。
②转染后第3天，即Day 3，制备1个12孔培养板的饲养层细胞。
③转染后第4天：将转染的细胞用0.05%Trypsin消化，用细胞基础培养液终止，收集细胞悬液至1个15 mL的离心管中，室温1000 r/min离心5 min；弃上清，用5 mL iPSCs诱导培养液将细胞重悬，并用细胞计数板计数；按照1.25×104 cells/孔的密度，将转染的细胞接种到12孔培养板的饲养层细胞上，用iPSCs诱导培养液培养，每天为细胞换液。
！注意：接种在饲养层细胞上的细胞的密度对于诱导效率有很大的影响，如果密度太高（＞1.5×104 cells/孔），在诱导晚期会出现明显的细胞死亡。
④每天观察细胞形态的变化，当出现与正常的mESCs形态接近的克隆时，即可挑取克隆进行单克隆培养，一般转染后12～21天开始挑克隆；miPSCs细胞核大，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单，细胞排列紧密，呈集落状生长。如图4-1所示为MEF感染Sox2、Oct4、Klf4、C-Myc因子后形成的iPSC克隆。
⑤克隆挑取前一天，制备多个4孔培养板的饲养层细胞。
⑥挑克隆：在多个国产35 mm培养皿盖上制备4个0.25%Trypsin滴，放在培养箱中。
！注意：制作酶滴一定要在非贴附的皿上进行，否则酶滴易扩散。
⑦在酒精灯上拉制数根玻璃针，要求针尖较细（孔径应相当于一个克隆大小）。
！注意：挑克隆的针与吹吸克隆的针的口径应该不同，挑克隆的针口径较大（与一个克隆的大小接近），吹吸克隆的针口径较小（要比克隆小）。
⑧为4孔培养板的饲养层细胞换液，换为miPSCs培养液。
⑨在体视镜下，用玻璃针挑取较好的克隆，转移到0.25%Trypsin滴中消化5 min，将消化完的克隆吸到4孔培养板中，并用移液枪反复吹打，直至将克隆吹打成单细胞。。