重大突破！科学家利用iPSC首次培养出高度成熟神经元

　　自 2006 年山中伸弥等发现了将体细胞诱导为多能干细胞的奥秘后，越来越多研究者的目光聚集到了这一领域。人们相信诱导多能干细胞（iPSC）可被用于广泛的体外研究，甚至用于更加精准的定制化细胞疗法中。不过，尽管研究人员已经可以分化干细胞成为神经元，但这些神经元在功能上还是不成熟的，这极大的影响了iPSC衍生神经元的应用和研究潜力。

　　2023 年 1 月 12 日，西北大学的研究者们在体外条件下由 iPSC 创造出了高度成熟的人类神经元，这项工作将为神经退行性疾病以及创伤治疗领域的研究开辟新的机会。

　　Samuel I. Stupp 博士与 Evangelos Kiskinis 博士团队利用超分子纳米纤维（supramolecular nanofiber）生成适用于神经元的细胞外环境（ECM），诱导了细胞的分化以及功能形成。该项研究以 Artificial extracellular matrix scaffolds of mobile molecules enhance maturation of human stem cell-derived neurons 为题，在 Cell Stem Cell 期刊上线上发布。[1]

　　超分子纳米纤维——新型 ECM

　　利用 iPSC 模型研究人类神经系统相对体内研究有着诸多优势。然而其重大的限制之一是无法有效模拟成熟神经元的功能。文章通讯作者 Stupp 博士说：“将 iPSC 诱导成为神经元，我们得到的是初生神经元。但想要在疾病治疗的研究中发挥作用，我们需要成熟的神经元。否则就如同让一个孩子去干成人才能完成的活儿了。”[2]

　　为了突破这一难题，研究团队试图从神经元的 ECM 入手。经过长期的研究，人们普遍认为 ECM 对于细胞功能的维持、细胞分裂、自体更新以及干细胞分化等都起着重要的作用。[3] 针对 iPSC 诱导神经元的研究，当前的可及的 ECM 方案主要采用了二维平面上包被 laminin的方式，而 laminin 是体内神经元 ECM 的主要成分之一并在成熟的脊髓的细胞中高表达。然而，在类似的二维环境中，神经元常常产生大量聚集，这不仅使得利用高分辨率显微镜进行观察极其不便，也不可避免地阻碍了神经元的成熟，以及后续的相关研究。于是，研究团队创造性地利用超分子纳米纤维生成了神经元 ECM。

　　该种超分子纳米纤维由肽两亲分子（peptide amphiphiles，PA）自组装形成，暴露在表面的是源于 laminin α-1 的肽段（异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸）。研究团队针对性地对中间的链接部分进行了优化改造，从而创造出了三种具有不同移动性的超分子纳米纤维 PA1、PA2 与 PA3。团队首先利用冷冻透射电镜与扫描电镜（cyro-TEM 与 SEM）验证了肽两亲分子的成功自组装，接着用窄角 X 光散射（SAXS）、广角 X 光散射 （WAXS）、原子力显微镜（AFM）、弛豫核磁共振光谱（T2-NMR）等验证了超分子纳米纤维的结构，并展示了 PA2 相对于 PA1 与 PA3 的高流动性、高移动性与高水合性。

　　超分子纳米纤维支持神经元成熟化

　　团队将由人类 iPSC 诱导的运动神经元生长在由 PA1、PA2、PA3 超分子纳米纤维形成的 ECM 或者商业化的 laminin ECM 上，均观察到有效的细胞贴附。纳米纤维培养的细胞β1-integrin（ITGB1）高表达，且在纳米纤维上的细胞贴附依赖于 ITGB1。

　　接着，团队将细胞培养的时间延长到 60 天，惊奇地发现在纳米纤维上细胞生长良好，而 laminin 上的细胞层厚度大大减小。通过蛋白质谱以及基因聚类分析，团队识别到多个重要通路，包括“细胞-基质贴附”、“肌丝-微观组织”、“细胞运动调控”以及“细胞凋亡”等通路在纳米纤维上的运动神经元中得到调控。而这些通路中的大多数都已在之前的研究中被确定可以被 intergrin 调控。细胞层面上，纳米纤维培养的细胞存活率较 laminin 更高。而其中 PA2 培养的细胞，则有更大的神经元胞体，更长、更复杂的分支形成以及更广泛均匀的细胞分布。

　　神经元功能性上，团队展示了 PA2 培养的神经元细胞相较 PA1、PA3 和 laminin 培养的细胞有更高的突触前和突触后相关蛋白表达。利用单细胞膜片钳，团队发现 PA2 培养的细胞产生更强更密集的电位；多电极阵列也显示了类似的结果。这些均说明 PA2 培养的细胞更加成熟，功能也更完备。

　　超分子纳米纤维支持

　　神经退行性疾病的新型体外模型构建

　　为了探索利用该纳米纤维研究神经退行性疾病的可能性，团队选取了肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）作为模型。团队将一种被广泛运用的 ALS 细胞模型，SOD1+/4AV 培养在 PA2 上。团队发现与 laminin 培养相比，PA2 培养的突变细胞表现出更多的 SOD1 与 ubiquitin 蛋白聚集，而这正是 ALS 发病的组织学特征之一。

　　文章另一位通讯作者 Kiskinis 博士指出：“这是我们第一次能够在 iPSC 诱导的体外实验中看到成人 ALS 神经元的错误蛋白聚集，这是一项突破。虽然我们目前还不知道出现这一症状的原因，但我们期待在未来可以更好地解释该疾病。”[2]

　　本研究突出展现了利用具备高流动性的超分子纳米纤维构建 ECM，使得 ECM 与神经元的接触更加动态化的新型体外培养方式。这可以更好地维持神经元功能，促进神经元成熟。以该培养方式为基础的体外模型，可以用于包括肌萎缩侧索硬化症、阿尔兹海默症、帕金森病在内的各项神经系统疾病的研究。更进一步地，提取病人的细胞进行重编程，以生成正常的细胞用于治疗各项疾病也将成为可能。