层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析1

一、实验目的和内容

目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；

2. 熟悉凝胶层析的一般过程；

3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。

内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；

2. 凝胶柱柱效测定；

3．凝胶再生的方法。

二、实验仪器和试剂

1. 实验仪器

层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管

易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

2. 实验材料和试剂

Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）

三、实验步骤

清洗层析柱

测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积

根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量

称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS

在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去

用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出

关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液

（重复使用的填料，从此步开始）

边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降

等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积

待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口

通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)

始终保护凝胶上端有一段液体