差异DNA的PCR扩增实验

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)

2. 酶和酶缓冲液

PCR 反应缓冲液，10X

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品（即方案 2 第 16 步中的各消减样品）

嵌套 PCR 引物 NP1(10umol/L)

嵌套 PCR 引物 NP2R(10umol/L)

PCR 引物 PI(10umol/L)

来自方案 1 第 4 阶段第 8 步的未消减检测者对照

4. 专用设备

热循环仪，预设至 72°C

5. 附加试剂

2% 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

二、方法

1. 初级 PCR

（1）每个稀释的 DNA 样品（即方案 2 第 16 步中的各消减样品，以及方案 1 第 4 阶段第 7步中相应的稀释但未消减的检测者对照），各取 1ul分装到准确标记的离心管中。冷冻的样品应该解冻，并在 72°C 温育，然后吹吸混匀再使用。

（2）另取一个离心管，为所有的初级 PCR 管配制一个主体混合液。按照下面的顺序将试剂混合。

灭菌水                                     19.5ul

PCR 反应缓冲液，10X            2.5ul

dNTP 溶液（10mmol/L)           0.5ul

PCR 引物 PI(10pmol/L)           1.0ul

50X 聚合酶混合液                   0.5ul

总体积                                     24.0ul

（3）取 24ul 主体混合液，分装到第 1 步准备的各反应管中。

（4）用 1 滴矿物油覆盖。

（5）在热循环仪中，将反应混合液 74°C 温育 5 min，以延伸接头。这一步「填充」接头所缺失的链，因而产生了 PCR 引物的结合位点。不要将样品从热循环仪中取出。

（6）立即开始下面的循环。

（7）从每个管中取 4ul, 在 2.0% 琼脂糖 TAE 凝胶上分析。

对于某些复杂的消减（复杂的组织或其核基因钽），建议分两步进行初级 PCR, 这样可以显著降低背景。首先，进行本方案所描述的初级 PCR, 然后按照方案 4 第 1 阶段笫 10 步所描述的步骤再进行一次初级PCR。最后再逬入次级 PCR(方案 3)。

2. 次级 PCR

（8）每个初级 PCR 产物各取 2ul, 用 38ul 水稀释。

（9）从第 1 步稀释的各初级 PCR 产物中，各取 lul，加到标记好的离心管中。

（10）按照下面的顺序将试剂混合，为次级 PCR 及一个附加反应的样品配制主体混合液。

灭菌水                                            18.54ul

PCR 反应缓冲液，10X                    2.5ul

嵌套 PCR 引物 NH(10umol/L)         1.0ul

嵌套 PCR 引物 NP2R(10umol/L)     1.0ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)                 0.5ul

50X 聚合酶混合液                           0.5ul

总体积                                             24.0ul

（11）将 24ul 主体混合液分装至第 2 步的各反应管中。

（12）用 1 滴矿物油穎盖。

（13）立即开始下面的循环。

（14）从每个管中取 4ul，在 2.0% 琼脂糖 TAE 凝胶上分析。

（15）反应产物应保存在- 20°C。现在，这个 PCR 产物就富集了差异 DNA。

如果不需要 MOS, 就可以直接进入「消减 DNA 的克隆」这一部分。