差示反转录PCR实验

实验方法原理 几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。

实验材料 红豆杉细胞

试剂、试剂盒 丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺SuperscriptTMⅡ试剂柠檬酸钠Taq DNA聚合酶dNTPs十二烷基肌氨酸钠巯基乙醇RNAimage试剂盒异硫氰酸胍焦碳酸二乙酯

仪器、耗材 基因扩增仪凝胶成像系统超低温冰箱电热鼓风干燥箱超净台脱色摇床核酸定量仪多用电泳仪DNA序列分析电泳槽

实验步骤

一、实验材料

1.  红豆杉细胞

未经MJ诱导处理的A和经MJ诱导处理的B红豆杉细胞。

2.  寡核苷酸引物

（1）3’锚定引物：

①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’

②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’

③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’

（2）5’ 随机引物：

Kit引物：

①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’

②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’

③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’

④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’

⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’

⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’

⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’

⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTTACCGC-3’

生工引物：

①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTCATTCCG-3’

②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCCACGTA-3’

③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’

④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’

⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTCGGCATA-3’

⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’

⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTACGCAAC-3’

⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’

特异引物：

①5ac： 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’

②ck5： 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’

③10ac： 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’

④10acb： 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’

⑤2ben： 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’

⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’

⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’

二、 实验方法

2.  总RNA的提取与检测

（1）用品的准备

塑料器皿，如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌后4℃保存；玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。

（2）试剂的配置

① CSB缓冲液

42 mmol/L 柠檬酸钠（Sodum citrate）

0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸钠（N-lauryl sarcosine）

0.2 mmol/L 巯基乙醇（β-mercaptoethanol）（使用前加入）

（3）RNA提取

对悬浮培养细胞A、B进行RNA提取，提取步骤如下：

① 50 ml 离心管中加入10 ml 变性匀浆液，冰浴5分钟。

② 取0.5 g 细胞在液氮中研磨至粉末，转移至预冷的变性匀浆液中，加200 ul β-巯基乙醇，振荡混匀。

③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸钠（pH4.0），充分混合。

④  加入10 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。

⑤ 加入2 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。

⑥ 4℃，12 000 g，离心20分钟。

⑦ 小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。

⑧ 加入6 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。

⑨ 加入6 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。