带您了解基因测序技术的发展

　　在生物多样性急剧减少和物种消失的时代，有时被称为“第六次大灭绝”或“全新世灭绝”，人们对开发有效的生物多样性研究和监测工具提出了很高的要求。迄今为止，世界各地的分类学家已经描述了超过170万个物种。然而，这只是地球上预计存在的数百万生物的一小部分。当试图使用传统的基于形态学的方法对所有物种进行分类时，生物多样性的绝对规模是一个巨大的挑战。据估计，仅描述500万种动物物种的成本就可能高达2500亿美元，需要6个世纪才能完成。

　　基于形态的分类学充满了局限性，例如难以描绘形态上隐蔽的物种以及合格的分类学家数量的减少。这些限制产生了对更多创新分类法方法的需求。2003年，Paul Hebert和他的同事展示了采用基于基因组的方法进行分类鉴定的方法。这种方法，被称为“DNA条形码”，是为了利用大多数真核生物中存在的短而保守的基因区域，提供快速准确的生物鉴定而开发的。从那时起，DNA条形码已成为生物有机体快速鉴定的一种既定方法。

　　今天，第一代桑格测序被广泛认为是DNA条形码项目的“黄金标准”。当测序少于800个样本时，它仍然是一种具有成本效益和准确的方法。然而，近年来，测序技术发展迅速。高通量，下一代测序(NGS)技术，如Illumina或Ion Torrent，使用户能够在单个测序实验中多重处理数百个样品，从而降低了成本，同时产生高度准确的测序数据。当将大量扩增子(数千个样本)合并到一次运行中时，NGS的成本效益变得更加经济实惠，尽管管理所有样本和扩增子对于下游分析可能变得非常困难。然而，NGS测序技术的局限性在于它们只能对大约100-600 bp的短DNA片段进行测序。这比大多数首选的DNA条形码(如CO1 (650 bp))要小，尽管最近的一项研究指出，长产品(主要基于引物选择和Sanger测序限制，而不是严格的测试)不再需要准确性。最近，高通量第三代测序(TGS)平台已经发布，使研究人员能够对更长的reads进行测序，克服了NGS方法的局限性，同时保留了其优势，即对数百个样本进行多路复用，并为同一样本获得更多数据点。领先的TGS技术由太平洋生物科学公司(PacBio)和牛津纳米孔技术公司(ONT)提供。

　　PacBio Sequel系列测序仪(Sequel I, II和IIe)使用单分子实时(SMRT)测序来生成高精度的长读序列。在SMRT测序中，发夹接头连接到双链DNA模板上，形成一组封闭的环状模板，称为SMRTbell库。测序引物被退火到SMRTbell文库，以促进DNA聚合酶的结合，DNA聚合酶作为测序细胞底部的锚点，并标记出测序的初始位点。该循环模板被反复测序以产生子reads，然后在循环共识测序(CCS)模式下使用，以产生精度大于99.9%的HiFi reads。

　　ONT技术依赖于嵌入在导电膜中的蛋白质纳米孔。当单个DNA链通过孔时，它们引起离子电流的变化，然后用于实时表征每个核苷酸碱基。该技术有多种配置的测序流式细胞和化学试剂，从可扩展的测序仪(例如Flongle, MinION流式细胞的廉价低容量替代品)到最高通量的PromethION流式细胞。目前，ONT使用新的Q20+化学和改进的碱基调用软件，拥有99%的模态原始读取精度。