常用电镜原位杂交技术的基本程序

原位杂交技术自创立以来，为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病理学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料，发挥了其他技术难以取代的作用。但不论是使用放射性核素探针，还是非放射性探针，大部分研究工作都还限于光镜水平。为了对检测的靶核酸进行更精确的亚细胞定位，以及能观察含靶核酸序列细胞的超微结构，人们便将原位杂交与电镜技术相结合，使原位杂交从光镜水平延伸到电镜水平。

     根据杂交反应是在组织包埋前进行、包埋后进行还是在不经包埋的细胞、染色体整体标本或冷冻超薄切片上进行，电镜原位杂交技术大体上可分为包埋前、包埋后和不包埋三类。其中以包埋后法制片比较容易，应用较广泛。

    包埋后电镜原位杂交的特点是杂交反应在电镜包埋后的超薄切片上进行。这一技术能否成功的关键取决于电镜包埋过程是否能把细胞中的靶核酸保留在它们原来所在的亚细胞结构上。一般认为，常规的包埋剂（疏水性树脂）不适用于包埋后原位杂交。如环氧树脂，需要在较高的温度下（60~C）经48小时才能聚合，长时间的高温包埋过程会影响组织内核酸的保留，而且树脂的疏水性也不利于在亲水条件下进行的杂交反应。包埋后原位杂交常用的包埋剂都是亲水性树脂，如Lowicryl K4M、比乙二醇甲基丙烯酸酯及LR White等。

    由于铜可能与以后使用的某些试剂发生化学反应，故超薄切片应载于镍网或金网上而不能载于铜网上。

    在超薄切片上进行原位杂交的基本步骤与光镜原位杂交类似．但杂交前一般不用蛋白酶K、去污剂或酸类处理，或用低浓度的去污剂短时间处理，但可用预杂交液减弱背景。将载网漂浮在蜡膜上的液滴上进行反应和洗涤。

    包埋前法是在冷冻或振动切片上先行原位杂交，然后作电镜包埋和超薄切片。包埋前法可与光镜原位杂交检测相连续．易获得阳性结果，但超微结构损伤较严重，且细胞膜可阻碍探针进入靶位。

    不包埋法在冷冻超薄切片上进行，但冷冻超薄切片技术要求高，费用大，尚难以普及。