常规蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

聚丙烯酰胺凝胶, 是由丙烯酰胺单体( Acr ) 和少量的交联剂N, N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis) , 在催化剂(过硫酸铵或核黄素, 前者为化学聚合, 后者为光聚合) 和加速剂( N, N, N’,N’-四甲基乙二胺) 的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。改变单体浓度或单体与交联剂的比例, 可以得到不同孔径的凝胶( 孔径大小可以通过改变单体Acr 的浓度或单体与交联剂的比例而控制) , 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE ) 。一般采用7 . 5% 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质,2 . 4%聚丙烯酰胺凝胶分离核酸。的顺序排列形成一个个区带。不连续聚丙烯酰胺凝胶系统所具备的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。电泳完后的蛋白质染色目前常用的是考马斯亮蓝染色法( 比氨基黑染色灵敏度提高, 可以进行定量扫描, 比银染色简便)。

蛋白质

Tris 甘氨酸 四甲基乙二胺 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 水 HCl 过硫酸铵溶液 溴酚蓝 蔗糖考马斯亮蓝 过氯酸 醋酸

电泳仪 垂直板电泳槽 微量加样器 长针头的注射器 烧杯 试管 长滴管 平皿 琼脂

1.  电泳装置安装
 

把干净、干燥( 如果不干净可用无水酒精棉球擦洗) 的两块玻璃板( 一块高, 一块矮) 分别小心地插入U 型软橡胶槽中,并组装到电泳装置中( 高玻璃一边靠正极) , 把相应的梳子插入两玻璃板之间, 来回均衡用力地调节电泳装置上的四个螺丝, 直到四个螺丝受力一致, 梳子能自由取出、插入为止, 取下梳子待用。

2.  封口
 

（1）将整个电泳槽以60 度左右的倾斜度摆好, 正极朝上。
 

（2）用滴管吸取刚熔化的1%的琼脂, 小心地加到U 型橡胶槽底部, 其高度约0 . 5 cm, 静止不动, 15 ～ 20 min 左右完全凝聚。

3.  制胶
 

（1）在小烧杯中按以下比例配好分离胶( 充分混合好但又不能带入太多的空气)

将配好的分离胶沿着高玻璃一边缓缓地倒入玻璃板之间, 约10 cm 高, 倒好后, 电泳槽垂直放好, 用长针头注射器吸取1～2 ml 水, 针头平口一边贴着玻璃慢慢地在胶面上封上一层水, 这时胶与水交界面处能看到一条清晰的界面, 后逐渐消失, 置30～40 min 左右, 又出现清晰的界面后, 用长针头注射器小心地吸出水, 接着用滤纸吸取剩余的水分。

（2）在小烧杯中按以下比例配好浓缩胶( 充分混合好)
 

将小烧杯中的浓缩胶沿着高玻璃一边缓缓地倒入玻璃板中已凝聚好的分离胶上, 直到离玻璃板顶端5～10 mm 时, 插入梳子,约15～20 min 待胶凝固后, 小心地取出梳子, 即可见多个样品槽。

4.  加样、电泳
 

（1）用大烧杯取800 ml 电极缓冲液加到电泳槽中, 电极缓冲液盖住矮玻璃, 接上电源, 电压调到50 V, 用100 μl 加样枪取10～30 μl 样品加入到样品槽中。

（2）将电压调到100 V, 等到溴酚蓝走过浓缩胶后, 将电压调到150 V, 待溴酚蓝离底部0.5 cm 时( 约3 h ) , 切断电源, 拔去插头, 倒出电极缓冲液。

5.  剥胶、染色、脱色

松开四个螺丝, 取出夹胶的玻璃板并置水中, 轻轻地将玻璃板与胶分离, 用刀切下浓缩胶部分弃之, 剩余部分放入盛有染色液的大平皿中, 1 h 后, 将染色液倒入回收瓶中, 将染好的胶用自来水冲洗几遍, 加入脱色液, 放到脱色摇床中进行脱色, 第2天看结果。