常规PCR反应的优化

A. DNA模板：

·   尽量使用高质量、纯化后的DNA作为模板

·   需要提高保真度时，可使用较高的DNA模板浓度并减少循环数

·   模板用量：以50 μl反应体系为例——

        人基因组DNA：0.1~1.0 μg

        大肠杆菌基因组DNA：10~100 ng

        Lambda DNA：0.5~5 ng

        质粒或病毒DNA：0.1~10 ng

B. 引物设计原则：

·  引物长度要满足特异性需要，一般可在18~25个碱基之间；扩增长片段时zui好在24~30个碱基之间；

·  当引入克隆位点时，引物末端应额外增加3个以上碱基；

·  (G+C)%含量应尽量控制在40~60%，两条引物的(G+C)%含量应尽量接近；

·  引物中GC碱基分布均匀；

·  尽量避免相同碱基连续出现三次以上，3’端应避免使用A或T；

·  避免引物内部自身配对形成二级结构；

·  正反向引物之间应避免配对碱基，尤其是3’端的三个碱基，否则易生成引物二聚体(Primer dimer)；

·  两条引物的解链温度（Tm）值应在42~65℃之间，而且两条引物间zui好相差不超过5℃；

·  引物Tm值的计算方法：

       20 nt以下：Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)

       20 nt以上：Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt：引物的碱基数)

·  引物用量：

·  0.1~1.0 μM，通常可以0.2 μM起始，根据体系不同调整用量；

·  使用简并引物、随机引物时，需增加引物总量以弥补产量损失；但随着引物量加大，特异性将降低；

·  模板较大较多，或结构较复杂(如人基因组DNA)时，需减少引物用量以提高特异性；

·  模板较小较少(如质粒模板)时，增加引物用量可提高产量。

C. 核苷酸（dNTPs）：

·  常规dNTPs浓度为每种核苷酸0.1~1.0 mM，通常可以0.2 mM起始，根据体系不同调整用量；

·  低浓度（0.05~0.1 mM）可增加保真性，但会降低产量；

·  高浓度提高产量，尤其是长片段PCR，但会降低保真度。

D. 镁离子浓度

·   对于Taq DNA聚合酶，镁离子的zui佳浓度为1.5~2.0 mM；

·   zui佳浓度取决于模板、缓冲液、DNA和dNTPs（每一种都有可能鳌合镁离子）；

·   镁离子浓度过低，会降低产量；

·   镁离子浓度过高，会增加非特异性PCR产物；

·   优化镁离子浓度时，通常以0.5 mM梯度递增，zui高到4 mM。

E. Taq DNA 聚合酶浓度

·   推荐使用浓度为 1~2.5 U/50 μl反应体系。

F. 起始反应

·   在冰上配制反应体系；

·   zui后加聚合酶；

·   将热循环仪预热至变性温度(94℃)后，放入PCR管，立即进行反应。

G. 变性温度与时间

·   通常于94℃初始变性，使DNA双链完全打开；

·   变性时间通常为15~30秒；

·   避免长时间或高温度孵育；

·   高GC含量模板可提高变性温度至98℃。

H. 退火温度与时间

·   通常情况下，退火温度为引物Tm值减5℃，在55~60℃之间；

·   提高退火温度有利于减少非特异性条带；

·   常规退火时间为15~30秒。

I. 延伸温度与时间

·   延伸反应通常在72℃下进行。

·   Taq酶的延伸时间大约为15~30秒/kb DNA；

·    产物小于1 kb时，建议延伸时间为30~60秒；

·    产物大于3 kb或反应超过30个循环时，可能需要更长的延伸时间。

典型的循环条件：

预变形94℃ 2 分钟

94℃ 30秒，

55℃ 30秒，

72℃ 1分钟/1 kb，25~30个循环

72℃ 5分钟

注：上述反应条件适用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反应。当DNA模板富含GC、具有复杂二级结构、低浓度或产物>5 kb时可能需要改变相应条件。