这里介绍的方法，是用一个生物素化的引物来帮助纯化第一链产物。这些纯化技术是可以互换的。与之类似，使用这里所介绍的基于寡核苷酸-(dT) 的引物，在反转录的起始阶段使用的基因特异性引物（如上所述）也是可以互换的。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。
| 试剂、试剂盒 | 寡核苷酸引物cDNA 文库HerculesHot-Start 聚合酶HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液dNTP 溶液TE反转录缓冲液RNasinSuperscript II 逆转录酶生物素标记的引物 Ptotal帽子发现接头引物poly(A)+RNA |
|---|
| 仪器、耗材 | 热循环仪链霉抗生物素蛋白磁性珠磁性分离器水浴或加热仪 |
|---|
| 实验步骤 | 试剂
5'RACE 能否成功依赖于帽子发现接头序列结合在 cDNA 合成的起始处。这一步依赖于在第一链 cDNA 末端附加额外的寡核苷酸（dC)。已有证据显示，反转录缓冲液如果存在Mn2+，能大大提高这一步的效率（SchmidtandMueller1999)。
第 1 阶段：反转录产生 cDNA 模板
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 各 10mmol/L)
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)，预热至 50°C
2. 酶和酶缓冲液
反转录缓冲液，5X(250 mmol/LTris-HCl、45°C 时 pH8.3,30 mmol/LMgCl2，10 mmol/LMnCl2，50 mmol/LDTT，1mg/mlBSA)
RNasin
Superscript II 逆转录酶（Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
生物素标记的引物 Ptotal(生物素标记的引物可以从 Invitrogen 订购）。Ptotal 引物的序列见图 25-6。
帽子发现接头引物（1mmol/L)。该引物的序列见图 25-6。
poly(A)+RNA
4. 特殊设备
链霉抗生物素蛋白磁性珠（例如 Promega 的 Streptavidin MagneSphere particles)
磁性分离器（例如 Promega 的 MagneSphere Magnetic Separation Stand)
预设为 42°C、45°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加热仪
二、方法
1.在一个无菌的离心管中，于冰浴上混合以下转录组分。
反转录缓冲液，5X 4ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 0.4ul
帽子发现接头引物（1mml/L) 1ul
RNasin(40U/ul) 0.25ul
2.在另一个管中，在 12ul 水中加入 lug 的 poly(A)+RNA 和 10pmol 的 Ptotal 引物，80°C 温育 3 min, 迅速在冰上冷却，在离心机中离心 5s，加入第一步的反转录组分。
3.加 1ul(200U) 的 Superscript II 逆转录酶，室温温育 5 min，42°C 温育 30 min，45°C温育 30 min，然后 50°C 保温 10 min。
4.70°C 温育 15 min，使逆转录酶失活，用链霉抗生物素蛋白磁性珠分离第一链 cDNA,要按照生产商的说明进行操作，链霉抗生物素蛋白磁性珠的用量是所用生物素化的引物的量的 5 倍。用 TE 在 50°C 洗 3 遍，去掉过量的帽子发现接头（按照生产商的说明）。
5.用 TE 将反应混合物稀释至 0.5 ml,4°C 保存（这就是 cDNA 文库）。
第 2 阶段：cDNA 的扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（含 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)
2. 酶和酶缓冲液
HerculesHot-Start 聚合酶（Stratagene)
HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液（10X)
也可以用其他的热启动 PCR 系统，例如 Roche 的 Expand High Fidelity 系统。
3. 核酸和寡核苷酸
生物素化的 cDNA 文库（由第 1 阶段得到）
寡核苷酸引物 GSP1 和 Po(用于 3'RACE), 或 RGSP1 和 Uo(用于 5'RACE),Po 和Uo 的序列见图 25-6
4. 特殊设备
可设程序的热循环仪
5. 其他
如果需要进行第二轮扩增，在第 5 步和第 6 步需要下列试剂。
引物 GSP2 和 Pi(用于 3'RACE)，或 RGSP2 和 Ui(用于 5'RACE)。Pi 和 Ui 的序列见图 25-6。
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)
二、方法
1. 第一轮
(1) 在一个无菌的 0.2 ml 离心管中混合以下组分。
Hercules Hot-Start 聚合酶缓冲液（10X) 5ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1.0ul
HerculesHot-Start 聚合酶 2.5U
H20 至 50ul
(2) 加入 1ul 的 cDNA 文库（充分重悬磁性珠）和 25pmol 的 GSP1 与 Po 引物（用于 3'RACE)，或 25pmol 的 RGSP1 与 Uo 引物（用于 5'RACE)。
(3) 在热循环仪上 98°C 加热 5 min，使第一链产物和链霉抗生物素蛋白变性，并激活聚合酶。冷却至合适的温度退火 2 min,72°C 延伸 40 min。没有必要在溫育过程中使链霉抗生物素蛋白磁性珠保持悬浮状态，因为生物素不能与变性的链霉抗生物素蛋白相互作用。据报道苯乙烯珠更小，在不搅动的情况下能保持悬浮状态，因此更有优势（Schrammet al.2000)。
(4) 按下列程序进行 30 个扩增循环。
72°C 延伸时间一定要根据产物的大小和所用聚合酶的扩增速率进行调整。
2. 第二轮（如果需要）
(5) 取第一轮的部分扩增产物，用 TE 以 1:20 稀释。
(6) 用第一轮的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C 40 mm 的延伸步骤，用 GSP2 和 P1引物（用于 3'RACE), 或 RGSP2 he U1 引物（用于 5'RACE) 扩增 1ul 上述稀释材料。 展开 |
|---|
