应用于原代T细胞酪氨酸磷酸化蛋白质组的高灵敏度分析方法

　　应用于原代T细胞酪氨酸磷酸化蛋白质组的高灵敏度分析方法

　　梁富超#, 柯弥#, 田瑞军*

　　南方科技大学理学院化学系, 广东 深圳 518055

　　摘要

　　酪氨酸磷酸化在T细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代T细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究T细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导致获得与原代T细胞相差较大的结论。因此,本研究发展了一种解析原代T细胞酪氨酸磷酸化修饰信号的高灵敏度的蛋白质组学方法。首先,针对原代T细胞数量有限的问题,本研究优化了一套从小鼠脾脏中分离、活化和扩增T细胞的完整流程,第4天时T细胞数量扩增到7倍以上；其次,针对酪氨酸磷酸化修饰丰度较低、不易被质谱检测的难题,本研究利用SH2超亲体(SH2-superbinder)亲和富集和固定化钛离子亲和色谱(Ti4+-IMAC)技术对抗CD3和抗CD28单克隆抗体共刺激条件下的原代T细胞多肽样品进行了酪氨酸磷酸化多肽富集,并结合纳升液相色谱-串联质谱(nanoLC-MS/MS)进行解析。最终成功从1 mg蛋白质中鉴定到282个酪氨酸磷酸化位点,其中包含T细胞受体膜蛋白CD3胞内区的免疫受体酪氨酸激活序列(ITAM)上的多个酪氨酸磷酸化位点,以及信号转导相关蛋白ZAP70、LAT、VAV1等的重要位点信息。综上,本研究发展了一套深度解析原代T细胞中的酪氨酸磷酸化修饰的高灵敏度蛋白质组学分析流程,有望应用于绘制更接近生理状态下的信号转导网络。

　　脾脏CD3+T细胞的分离培养

　　脾脏CD3+T细胞的磁珠分选

　　对C57BL/6J小鼠进行脱颈椎处死,迅速置于75%的酒精中进行表面消毒。使用灭菌器械迅速将小鼠的脾脏解剖取出,将脾脏组织置于4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液中备用。

　　将70 μm的细胞筛网置于50 mL离心管上,用1 mL冰冷的磷酸盐缓冲液对筛网进行润洗；将解剖出的脾脏组织置于细胞筛网上,使用注射器活塞研磨,同时向筛网上方加入预冷的磷酸盐缓冲液润洗,直至组织完全磨碎。将组织研磨液以400 g离心5 min,吸弃上清液。使用磷酸盐缓冲液将细胞进行重悬,使细胞密度达到1×108 cell/mL。按照STEMCELL公司的小鼠CD3+T细胞分选试剂盒说明书对CD3+T细胞进行分选,吸取分离得到的细胞,以400 g离心5 min,弃去上清液。

　　原代T细胞的活化培养

　　配制T细胞培养基,其主要成分为RPMI 1640空白培养基、10%(v/v)胎牛血清、1%(v/v)链霉素-青霉素混合液、50 μmol/L β-巯基乙醇和2 ng/mL 小鼠重组白细胞介素-2(IL-2)。

　　对培养T细胞的孔板进行抗体包被,用磷酸盐缓冲液对抗CD3和抗CD28抗体进行稀释,使两种抗体的最终质量浓度均为1 μg/mL,将配制好的抗体稀释液置于24孔板中,每孔1 mL, 4 ℃孵育过夜(14 h以上)。

　　弃去24孔板中的抗体稀释液,然后在每孔中种入1 mL密度为1×106 cell/mL的细胞。活化2天后,将细胞收集到离心管中,以500 g离心10 min,将细胞用配制好的T细胞培养基重悬,进行扩增培养。

　　流式细胞术检测

　　使用细胞计数板对扩增得到的细胞进行计数,取1×106个细胞,以500 g离心5 min,收集细胞沉淀,加入1 mL流式染色缓冲液吹打混匀,以400 g离心5 min,弃去上清液,加入80 μL流式染色缓冲液进行重悬,加入2 μL CD3-BV510或CD25-PE抗体混匀,室温避光孵育20 min。随后加入2 mL流式染色缓冲液轻柔洗涤细胞,以500 g离心5 min,弃去上清液,使用500 μL流式染色缓冲液重悬,上机检测。

　　原代CD3+T细胞的抗体刺激

　　将培养4天后的T细胞离心收集,使用不含胎牛血清(FBS)的RPMI 1640空白培养基对细胞饥饿处理4~6 h,重悬并计数,使每个样本细胞数量为1×108个(对照组3组,抗体刺激组4组),离心后使用1 mL RPMI 1640空白培养基重悬。放置冰上10 min,向其中加入5 μg/mL的抗CD3和抗CD28单克隆抗体,在37 ℃水浴锅中孵育5 min。孵育结束后,迅速向其中加入5×RIPA裂解缓冲液,置于冰上10 min。使用细胞超声破碎仪对细胞进行超声裂解,超声5 s,停止5 s,有效超声时间30 s以上。超声结束后,在4 ℃条件下以12200 r/min离心10 min,取上清液,采用PierceTM 660 nm蛋白定量试剂盒对蛋白质进行定量分析。

　　蛋白免疫印迹检测

　　使用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶,于每个泳道中加入20 μg蛋白质样品,120 V恒压条件下进行蛋白质分离(90 min), 200 mA恒流2 h将蛋白质转印至0.45 μm孔径的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。PVDF膜用奶粉封闭2 h。使用含有0.1% Tween 20、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl的缓冲盐溶液(TBST)洗涤3次后加入抗磷酸化的ERK1/2抗体,于4 ℃摇床孵育过夜。次日,用TBST缓冲液洗涤3次,每次5 min。然后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)的二抗,室温孵育2 h。二抗孵育结束后,使用TBST洗涤3次,每次5 min。最后向PVDF膜加入增强型化学发光显影液进行显影。

　　样品处理

　　蛋白质酶解除盐

　　从抗CD3和抗CD28两种单克隆抗体刺激后的原代T细胞蛋白裂解液中取出1 mg的蛋白质,使用甲醇-氯仿法进行蛋白质沉淀。使用500 μL含有8 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)对蛋白质沉淀进行复溶。然后加入终浓度为10 mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)(55 ℃, 30 min)和30 mmol/L的碘代乙酰胺(IAA)(室温,避光,15 min)进行还原烷基化。之后,加入终浓度为30 mmol/L的DTT(室温,30 min)终止反应。进一步,用7倍溶液总体积的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)稀释样品,并加入终浓度为1 mmol/L的CaCl2。最后加入胰蛋白酶(酶与蛋白质的质量比为1∶20),于37 ℃酶解16 h后,向酶解溶液中逐步、少量加入10%(v/v)三氟乙酸(TFA, HPLC级)对多肽进行酸化(pH 2~3)。然后高速离心去除沉淀后,收集多肽上清液后使用SPE除盐柱,按照Waters公司除盐柱说明书的步骤进行多肽除盐。

　　酪氨酸磷酸化多肽富集

　　使用免疫亲和纯化缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8)、10 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaCl)复溶多肽,并利用1 mol/L Tris-HCl缓冲液调节pH至7.5左右,向溶解的肽段中加入带有工程化的SH2结构域蛋白的微球孵育过夜。使用冰上预冷的免疫亲和纯化(IAP)缓冲液清洗3次,向其中加入含有500 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱2次,最后加入10%甲酸水溶液将多肽酸化至pH 2~3。使用含有10层C18膜片的200 μL移液器枪头进行除盐,除盐产物使用装有Ti4+-IMAC填料的200 μL移液器枪头进一步纯化,使用10%氨水进行洗脱。使用装有3层C18膜片的200 μL移液器枪头对洗脱下的酪氨酸磷酸化多肽进行除盐,肽段冻干后,使用12 μL含有4%(v/v)甲酸和5%(v/v)乙腈的水溶液进行复溶

　　nanoLC-MS/MS分析

　　采用Easy nano-LC1200色谱系统,使用内径为100 μm的20 cm自制毛细管分析柱,其中填充0.5 cm C4树脂填料(颗粒尺寸为3 μm,颗粒孔径为12 nm)和19.5 cm C18树脂填料(颗粒尺寸为1.9 μm,颗孔径为12 nm),流速为250 nL/min,流动相A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为含0.1% (v/v)甲酸的90%(v/v)乙腈水溶液。梯度洗脱程序如下:0~2 min, 4%B~8%B； 2~57 min, 8%B~28%B； 57~62 min, 28%B~40%B； 62~64 min, 40%B~97%B； 64~80 min, 97%B。

　　采用纳流电喷雾离子源,电压1800 V,离子传输毛细管温度为300 ℃,以数据依赖采集模式运行。一级质谱参数:扫描范围为m/z 350~1550,分辨率为120000,自动增益控制目标(AGC target)为3×106,最大注入时间为20 ms。二级质谱参数:分辨率为15000, AGC target为1×105,最大注入时间为40 ms。

　　数据分析

　　使用MaxQuant (版本1.5.5.1)软件对质谱数据进行分析,使用Uniprot数据库中的Mus musculus数据库(2020年10月6日,86477个蛋白质),胰蛋白酶酶解,半胱氨酸烷基化(C,+57 Da)为固定修饰,酪氨酸磷酸化(Y,+79.97 Da)、甲硫氨酸氧化(M,+16 Da)、肽段N端的乙酰化(N-terminal,+42 Da)、天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺修饰(N/Q,+0.98 Da)为可变修饰。允许最大漏切位点为2。蛋白质和肽段鉴定的错误发现率(FDR)控制在1%以内。蛋白质鉴定标准为至少检测到2个特征性肽段。使用Perseus(版本1.5.5.3)软件进行数据加工并生成火山图。

　　结论

　　本研究发展了一种研究原代T细胞酪氨酸磷酸化蛋白质组的高灵敏度分析方法。实现了原代T细胞的分离、活化及扩增培养,通过SH2超亲体和Ti4+-IMAC联用的高灵敏度富集策略,借助nanoLC-MS/MS技术解析了T细胞激活过程中的酪氨酸磷酸化位点变化信息,最终从1 mg的原代T细胞的蛋白起始量中解析了包括T细胞受体蛋白CD3的多个侧链以及许多胞内信号转导相关蛋白ZAP70、LAT、VAV1等在内的282个酪氨酸磷酸化位点。

　　大量的研究表明,酪氨酸磷酸化修饰蛋白是许多药物的重要作用靶点。本研究优化的高度灵敏的蛋白质组学技术能够从原代T细胞中获得酪氨酸磷酸化位点信息,将为解析真实的药物靶标及其结合强度等方面带来新的认知。