建立一个实时PCR定量分析实验

MgCl2 探针 HotStmMix 正向和反向扩增引物 模板 DNA

PCR 仪 反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板

一、材料

1. 缓冲液和溶液

MgCl₂(25 mmol/L)

探针（例如分子信号）或 SYBRGreen(MolecularProbes)

2. 酶和酶缓冲液

HotStmMix，2X(含有 TaqDNA 聚合酶、PCR 缓冲液和 dNTP)

3. 核酸和寡核苷酸

正向和反向扩增引物

模板 DNA

4. 专用设备

实时 PCR 仪

合适的反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板（按照不同的方法选用）

二、方法 A----ABI7700ORI-CYCLER

1.在 96 孔的微量滴定板上为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。

2XHotStartMix                                                    25ul
引物 A                                                               0.1~ 0.5umol/L
引物 B                                                               0.1~ 0.5umol/L
探针或 SYBRGreen                                          0.1~ 0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                             3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                    10ul
水                                                                      补满到 50ul

2.使用两步（所有的 ABI7700TaqMan 定量分析）或三步 PCR。对于三步 PCR, 利用如下条件运行 40~50 个循环进行扩增。



对于两步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火温度到 60°C。
*取决于 HotStart 程序。

3.继续进行下文步骤④的优化方案。

三、方法 B—SMARTCYCLER

1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen, 按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。

2XHotStartMix                                              2.5ul
引物 A                                                         0.3~0.8umol/L
引物 B                                                          0.3~0.8umol/L
探针或 SYBRGreen                                     0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                       3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                               5ul
水                                                                 补满到 25ul

Smartcycler 要求使用专用的管子。

2.利用两步或三步 PCR。对于三步 PCR，利用如下条件运行 40 个循环进行扩增。



对于两步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火温度到 60°C。
*取决于 HotStart 程序。

3.继续进行下文步骤4的优化方案。

四、方法 C-----LIGHTCYCLERPCR

1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。

2XFastStartMix                                              10ul
引物 A                                                            0.1~0.5umol/L
引物 B                                                            0.1~0.5umol/L
探针或 SYBRGreen*                                      0.1~0.5umol/L
MgCl₂(25 mmol/L)                                          3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                 5ul
水                                                                   补满到 20ul

*LightCycler 要求使用毛细管。

2.利用三步 PCR, 如下条件运行 40(原文为 45—译者改）个循环进行扩增。



3.继续进行下文步骤④的优化方案。
优化定置分析的实用方法（见 InnisandGelfand1990;HarrisandJones1997)

4.为了优化扩增子和引物，利用解链曲线功能分析实时 PCR 产物，此功能在 ABI770上不能直接获得。对单个产物而言，结果应显示其具有一个特异的解链峰，没有表明形成引物二聚体的次级烽。当解链曲线数据以一阶导数表示时将会是一单峰。多个峰表明有其他的扩增产物存在。如果检测到多个峰，说明可能需要进一步优化镁离子的浓度，但通常这表明需要重新设计引物。

5.为了优化探针，可利用靶分子的 1 倍稀释液，选择任意单位作标准曲线。例如假定DNA 的最高浓度值是 10⁷，由此它的 10 倍稀释系列分别定为 10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³。鍵入这些数值作为起始量，在定量分析结束时用软件作标准曲线。利用循环阈（Ct) 值和DNA 的起始浓度将可计算反应效率。

6.与常规 PCR 相似，需用一系列按 10 倍稀释的标准液做进一步反应，以优化 MgCl₂的浓度、引物浓度、探针浓度、退火温度，以及调整 PCR 方案。

7.对于本身没有快速循环操作方案的体系，可以尝试进行更短的循环方案，以减少定量分析的时间。