异构酶的测定实验

实验方法原理

D-木糖 ⇌ D-木酮糖

实验材料 酶溶液

试剂、试剂盒 TES NaOHD-木糖MnSO4半胱氨酸·HCl咔唑溶液硫酸

仪器、耗材 分光光度计

实验步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

20 ul 的实验混合物和 20 ul 酶溶液（各自用 20 ul TES 缓冲液作对照）混合，并在测定温度（例 50℃）下紧靠反应容器放置 15 min，在用冰冷却并加入 40 ul 半胱氨酸和 40 ul 咔唑溶液的情况下酶反应会停止，加入 1.2 ml 70％ 硫酸颜色开始变化，在室温下放置 10 min 后对比参照，在 546 nm 处测吸光值。

注意事项

过任何时间颜色也不会达到一个恒定量，因此，每隔 10 min 必须非常仔细地观察颜色的变化，在同样的时间间隔后所有的样品都被准确读数。空白对照的吸光值应该大约是 0.2，如果吸光值接近 0.3 则测定反应物需重新配制。为了定量，需要准备木酮糖的校对曲线，木酮糖浓度应在 0～10 umol/L 之间。

其他

试剂：

0.2 mol/L TES/NaOH，pH 8.0［N-tris（羟甲基）-甲基-2-氨甲基酸，Mr＝229.3；9.2 g 溶于 100 ml 水中，用 1 mol/L NaOH 调节至 pH 8.0，用水加至 200 ml］

0.4 mol/L D-木糖（Mr＝150.1；1.2 g 溶于 20 ml 水中）

0.03 mol/L MnSO4（单水化合物，Mr＝169.0；57 mg 溶于 10 ml 水中）

1.5％ 半胱氨酸·HCl（半胱氨酸·HCl-水合物，Mr＝175.6；溶解 1.5 g 在 100 ml 水中）

0.12％ 咔唑溶液（Mr＝167.2；120 mg 溶于 100 ml 乙醇中）

70％ 硫酸