张锋参与Cell发布CRISPR重要新成果

　　一直以来研究人员都无法在哺乳动物细胞中实现高通量的靶向基因编辑，CRISPR-Cas9系统的应用标志着遗传筛查一个重大的突破。

　　现在，来自哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人员将这一筛查技术应用于小鼠骨髓源性树突状细胞，研究了PAMPs触发的免疫反应的调控机制。通过综合分析基因敲除结果及蛋白质和mRNA表达改变，他们利用CRISPR筛查以前所未有的分辨率剖析了免疫调控网络。这一重要的成果发布在7月16日的《细胞》（Cell）杂志上。

　　哈佛-麻省理工Broad研究所的Aviv Regev博士和Nir Hacohen博士是这篇论文的共同资深作者。著名华人科学家、CRISPR-Cas9技术的先驱开创者张锋（Feng Zhang）博士是这篇论文的合著作者（延伸阅读：Nature大型访谈：张锋博士畅谈CRISPR改造生殖细胞 ）。

　　遗传筛查是一种可用于鉴别促成特异生物学表型或疾病环境的单个基因或基因网络的强大方法。RNA干扰（RNAi）技术是当前最有效的遗传筛查技术，但却存在着不完全基因抑制及广泛脱靶效应等问题。将CRISPR-Cas9基因编辑技术应用于各种细胞类型中进行正向遗传筛查，将从根本上提高在哺乳动物细胞中开展这类遗传筛查的能力。

　　去年的一年里，多个研究小组相继报道在哺乳动物癌症和干细胞系中采用CRISPR-Cas9系统进行全基因组基因敲除筛查，鉴别出了增殖必需的基因，并揭示出了介导对药物和毒素产生耐受的一些基因。2015年，一项在小鼠中完成的体内全基因组CRISPR筛查研究进一步鉴别出了驱动肿瘤生长和转移的功能丧失突变。这些初步的负向和正向选择筛查确立了开展全基因组CRISPR筛查的可行性，并显示了CRISPR在以高灵敏度和特异性生成一些新生物学见解方面的能力。

　　现在，哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人员利用这一技术解构了一个复杂的生物学过程，第一次在哺乳动物中应用CRISPR-Cas9解答了一个系统级生物学问题。研究人员报告称，他们筛查了原代的小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)，剖析了与诱导肿瘤坏死因子（TNF）相关的调控网络。

　　作者们利用分离自表达Cas9转基因小鼠的骨髓源性DCs研究了通过Toll样受体(TLR) 对脂多糖(LPS)产生的天然免疫反应。在用LPS激活DCs后，他们对这些离体细胞进行了全基因组混合CRISPR筛查，基于炎症细胞因子TNF的高水平或低水平蛋白质表达情况分选了这些细胞。这一初期的筛查鉴别出了大多数已知的TNF表达及TLR4信号调控因子，并用单条单向导RNA(Single guide RNA,sgRNA)验证了一些新蛋白。随后，研究人员对排名前列的2,569个基因进行了更深入的二次筛查，以更高的敏感度揭示出了另外一些TNF表达调控因子。

　　随后，研究人员基于它们对树突状细胞功能选择性标记物RNA和蛋白质表达的影响，对所有已知和新鉴别出的调控因子进行了赋值。除了已知的TLR信号调控因子，还鉴别出了由从前未发现与TNF调控或炎症基因表达相关的一些基因组成的两个组件：一个是OST蛋白质糖基化复合物和内质网（ER）折叠及易位信号通路；另一个是参与了转录延伸调控的PAF复合物。尽管尚不清楚OST和PAF复合物是如何在分子水平上影响TLR信号通路的，这一研究表明了需要无偏倚地去探查功能网络以了解细胞内一些生物学功能的关联。

　　哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人员所开展的CRISPR筛查其中一个新颖之处在于，他们将这一技术应用于原代细胞研究了与传染病相关的免疫信号。近期一项类似的研究报告称利用全基因组RNA干扰筛查，揭示出了由病原相关分子模式(PAMPs)触发的天然免疫信号。

　　在这项Cell研究中，作者们报告称发现了一个新的PAMP，并检测出了一些TRAF复合物组件，但这一筛查还远未达饱和。CRISPR-Cas9技术有潜力在哺乳动物细胞中实现饱和遗传筛查，使得能够解译出几近完整的分子信号通路。

　　研究人员结合CRISPR筛查和细胞分选，还揭示出了一些特殊蛋白质或细胞增殖之外一些生物表型的调控因子。这一方法可以适用于广泛的靶标，并有着巨大的潜力用于鉴别未确定特征的调控网络。

　　当我们学习将这一不可思议的技术应用于遗传筛查时，不应该忘记CRISPR-Cas9系统还有一些潜在的缺陷：例如，在进行全基因组筛查时，应考虑到由于低文库覆盖度或脱靶效应导致检测出一些假阳性和假阴性靶蛋白。

　　在这篇Cell文章中，研究人员采用一些策略：根据适当的阳性对照例如基因本体注释及一组参考必需和非必需基因来评估筛查性能，并测量初次筛查击中蛋白的频率有效地解决了这些问题。通过更深入的二次筛查研究人员减少了相比于全基因组文库的大小，有限的细胞数量造成的假阴性。

　　作者们指出，全基因组CRISPR筛查已经开始彻底地改变对调控网络的研究，并打开了通往系统层面上一些新研究发现的大门。