微囊藻毒素的LCMS／MS测定

水体中微囊藻毒（MCs）的检测方法已相对较完善，但鱼类等水产品中微囊藻毒素的限量还有待进一步的研究。本文报道了同时对鱼体中MC-RR、YR、LR、LW、LF进行定量分析的LC–MS/MS法，该方法具有优良的选择性，对样品的纯化步骤要求不高，能够在混合物中同时实现多种藻类毒素的分离和鉴定。

近几十年由于水体富营养化程度的日益加剧，包括水源水库水在内的淡水水体经常发生蓝藻水华。有害藻类水华的频繁发生已成为国内外普遍关注的环境问题。据2004 年资料，已从不同藻株中分离、鉴定了70多种微囊藻毒素。在已发现的蓝藻毒素中，微囊藻毒（Microcystins，MCs）是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、造成危害最严重的藻毒素种类。

MCs的一般结构为环（D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸）。其中，Adda（3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸）是一种特殊的氨基酸。在已发现的MCs异构体中，MC-LR，RR，YR 毒性最强（L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、色氨酸）。MCs是一种水溶性肝毒素，它对动物和人类健康的潜在危害逐渐引起关注。

由于藻毒素可通过食物链累积，供食用的水产品如鱼类、贝类等也可能携带藻毒素危害人类健康。为防止藻毒素对人类的进一步危害，需进行更广泛而深入的研究。目前WHO 仅规定了饮用水中微囊藻毒素可耐受量1.0μg/L，及暂定的微囊藻毒素临时可耐受的每日摄取量0.04 μg/（kg·d BW），结合各国微囊藻毒素的安全限量标准，微囊藻毒素每日安全摄入总量在2.4μg之内应是安全的。但鱼类等水产品中微囊藻毒素的限量还有待进一步的研究。鉴于微囊藻毒素对人体的危害，应逐步建立和完善水产品中MCs含量的检测方法，并制定食品中MCs的限量标准。

越来越多的分析技术被用于MCs的检测当中，水体中MCs中的检测方法已相对较完善。本文报道了同时对鱼体中MC-RR、YR、LR、LW、LF进行定量分析的LC–MS/MS法，这些毒素可产生典型的离子谱，质谱仪对藻毒素有很好的分辨效果，LC–MS/MS方法由于其优良的选择性，对样品的纯化步骤要求不高，能够在混合物中同时实现多种藻类毒素的分离和鉴定。

实验部分

仪器与试剂

液质联用仪由Surveyor液相色谱系统和Thermo Fisher TSQ Quantum三重四极杆串联质谱组成；氮气吹干仪（美国Zymark公司）；MilliQ去离子水发生器（美国Millipore公司）；Sartorius冷冻离心机；WH-861漩涡混合器。

二次去离子水；甲醇（色谱纯）；Oasis HLB固相萃取柱（Waters公司，60 mg，3 ml）；标准品：微囊藻毒素-LR（MC-RR），微囊藻毒素-LF（MC-YR），微囊藻毒素-YR（MC-LR），微囊藻毒素-RR（MC-LW），微囊藻毒素-LW（MC-LF），纯度不低于95%；鲫鱼样品来自市场，冷冻保存于实验室。

分别准确称取标准品各10.00 mg，至10 ml棕色容量瓶，用甲醇定容，-20℃避光保存。再用甲醇稀释上述标准储备液，配制成1.0 μg/ml的混合标准溶液，于4℃避光保存1个月。

样品前处理

1.提取

准确称取5.00 g鲫鱼试样均匀样品于100 ml离心管中，加入50?μl标准MC-RR、 YR、LR、LW、LF（1μg/ml），于液体混匀器（10000 r/min）上快速混合1 min，使标准品与试样混合均匀，再加入10 ml甲醇溶液，均质2min，超声15min，离心5 min（3000 r/min），将上清液转移到试管中，氮吹至约0.5 ml，加水至约10 ml。

2.净化

分别用5 ml甲醇、水活化HLB固相萃取小柱，流量为1~2 ml/min。将上述混合物转移到HLB小柱上，控制流上样流速为1~2 ml/min。用二次去离子水5ml淋洗，淋洗速度为1~2 ml/min，抽干，用甲醇溶液4 ml洗脱，洗脱流速约1 ml/min，收集洗脱液于50 ℃氮吹，甲醇-水（甲醇：水=3：7）定容至1 ml，过0.45μm的滤膜到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。

3．液相色谱和质谱条件

3.1液相色谱条件

色谱柱：Polaris C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm×5μm）；流动相：甲醇-0.1%（体积分数）甲酸水溶液；流速：0.25 ml/min；梯度洗脱程序：0.00min（20%甲醇，80%甲酸水溶液），4.00 min（95%甲醇，5%甲酸水溶液），8.00 min（95%甲醇，5%甲酸水溶液），8.10 min（20%甲醇，80%甲酸水溶液），10.00 min（20%甲醇，80%甲酸水溶液）；柱温：25℃；进样量：10μl。

3.2质谱条件

电离方式为电喷雾电离源（ESI+）；选择反应监测（SRM）；毛细管温度300 ℃；喷雾电压（spray voltage）3.5 kV；鞘气（N2）流量：6 L/min；辅助气（N2）流量：2L/min；碰撞气（N2）压力：1.5 mTorr。

结果与讨论

线性范围、定量限和检出限

将MC- RR、YR、LR、LW、LF逐级稀释配置成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/ml系列浓度的混合标样，在1.0~50.0 ng/ml内线性良好，当信噪比（S/N）为3时，方法检出限分别为0.2、0.3、0.3、0.4、0.4μg/kg。以3倍信噪比、10倍信噪比分别计算检出限和定量限，结果见表2，相关系数均大于0.99，显示了良好的相关性。MC- RR、YR、LR、LW、LF的检出限分别为0.7、1.0、0.8、1.2、1.3。

方法的精密度和回收率

在空白样品中分别添加不同含量水平的MCs标准液，按样品预处理方法处理，每个添加水平平行测定6次，LC-MS/MS检测，结果见表3。MC-RR、YR、LR、LW、LF的回收率均大于85%，相对标准偏差范围为6.0%~10.1%。

实际样品分析

鲫鱼样前处理和分析参照上述条件，鱼样中均未检测出MC-RR、YR、LR、LW、LF。