微生物的染色技术及显微镜观察（二）

二、革兰氏染色法
  1  目的
  1.1 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
  1.2 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。

2  原理
  革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain
  Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
  革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。

  革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

  3  材料
  3.1  菌种
  大肠杆菌（Escherichia  coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillus
  subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
  3.2  染色剂
  结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。
  3.3  仪器或其他用具
  显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。
  4  流程
  涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
  5  步骤
  5.1  涂片
  5.1.1  常规涂片法
  取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

  5.2  初染
  滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
  5.3  媒染
  用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。
  5.4  脱色
  用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
  革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。
  5.5  复染
  在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
  5.6  镜检
  干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
  5.7  实验结束后处理
  清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。

  三、实验结果
  1 根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
  2列表简述两株细菌的染色结果(菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。
  四、思考题
  1 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
  2 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
  3 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?
  4 不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？
  5 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节?
  6 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
  7 如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?