快速PCR定点突变实验

模板 DNA

ATP dNTP 溶液 SDM 缓冲液 Taq DNA 聚合酶 克隆化的 Pfu DNA 聚合酶 Taq Extender PCR 添加剂 Dpn I 限制性内切酶 T4 DNA 连接酶 模板 DNA dsDNA 质粒 LB 琼脂平板

FALCON 2059 管子或替代物 热循环仪 水浴或适当的加热装置 提前设定为 37°C、42°C、72°C  温箱 琼脂糖凝胶电泳试剂和装置

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ATP(10 mmol/L)

dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP, 每一种 6.25 mmol/L)

SDM 缓冲液，10X(20 mmol/L Tris-HCl、pH7.5,8 mmol/L MgCl₂，40ug/ml BSA)

2. 酶和酶缓冲液

Taq DNA 聚合酶

克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（Stratagene)

Taq Extender PCR 添加剂（Stratagene)

Dpn I 限制性内切酶

T4 DNA 连接酶

3. 核酸和寡核苷酸突变引物

模板 DNA,dsDNA 质粒，小量或大量制备 [O.5pmol 模板=(0.33ug/kb)X 模板大小（kb)]
摸板 DNA 必须有甲基化的 Gm6 ATC 序列，如果没有，在进行 PCR-SDM 之前必须在体外用 Dam 甲基化酶进行甲基化。
只有包含抑菌抗生素抗性基因（如青霉素、四环素和氯霉素）的质粒适用于这个快速方案，也能够使用包含杀菌抗生素抗性基因（如卡那霉素和链霉素）的质粒，但在应用抗生素选择之前必須使被转化的细胞有一个生长的过程。参见第 14 步的注释。

                                                  突变引物 [15pmol 引物=(5ng/碱基）X 引物大小（碱基）]

在一条或两条引物上有磷酸基团十分重要，这种引物能够被 T4 多聚核苷酸激酶磷酸化或者直接合成 5'末端磷酸基团 。

4. 培养基

LB 琼脂平板（10 g 细菌培养用酪氨酸，5 g 细菌培养用酵母提取物，10gNaCl, 加 H₂0 至 1L, 最终 pH7.0, 每升加入 15 g 琼脂）

5. 特殊设备

FALCON 2059 管子或替代物

热循环仪

水浴或适当的加热装置，提前设定为 37℃、42℃、72℃温箱，提前设定为 37℃

小离心管

6. 载体和菌株

E.coli 热休克感受态细胞（例如，XLl-blue，Statagene)

7. 附加项目

选项：琼脂糖凝胶电泳试剂和装置，包括溴化乙锭 (参见步骤 9）

二、方法

1.PCR

(1) 冰上，在一个已灭菌好的离心管中，混合 PCR-SDM 反应物。

模板 DNA                                   0.5pmol

SDM 缓冲液，10X                        2.5ul

dNTP 溶剂（6.5 mmol/L)             1ul

突变引物                                      每种 15pmol

H₂0                                              补齐至 24ul
 
(2) 加入 2.5U 的 Taq DNA 聚合酶和 2.5U Taq Extender PCR 添加剂。
这些酶能够混合在一起，并且能够以 1:1(体积比）的混合物形式在-20℃ 储存至少 3 个月。

(3) 按照如下的 PCR 条件进行 7~12 个循环的扩增。


可以根据不同种类的设备和反应体系对时间和溫度作出相应的调整，參见 31.2 PCR 注意事项。
如果热循环仪没有热盖，則要使用矿物油成石蜡来防止在 PCR 过程中反应混合物的蒸发。

2. 消化和拋光 PCR-SDM 产物

(4) 在 PCR 反应之后，将反应产物放置在冰上冷却 2 min。

(5) 将如下的组分直接加入到 25ul 扩增产物中。

Dpn I 限制性内切酶（10U/ul)1ul
Pfu DNA 聚合酶（2.5U/ul)1ul

如果在循环中使用矿物油覆盖在反应物上，那么在消化、拋光和连接过程中向反应管中加入附加组分的时候，一定要将微量移液器的尖端插入到矿物油层之下。

(6) 轻轻混合，然后将反应物置于一个离心管中离心 lmin。立即将反应物置于 37℃ 温育 30 min。

(7) 将反应物置于 72℃ 再温育 30 min。

3.PCR-SDM 产物的连接

(8) 将下列组分添加到用 Dpn I 和克隆化的 Pfu DNA 聚合酶处理过的产物中。

H₂O                                        100ul

SDM 缓冲液，10X                  10ul

ATP,10mmol/L                         5ul

(9) 轻轻混合，然后将反应物罝于一个离心管中离心 1min。
可选做：为了证明 PCR-SDM 产物的完整性，从样品中取出 5ul 在标准的琼脂糖凝胶电泳中分析。应该能够观察到单一条带。

(10) 从上述反应物中取出 10ul 置于一个已灭菌的离心管中，加入 4U 的 T4 DNA 连接酶 (4U/ul)。

似乎不同批次的 T4 DNA 连接酶对于平端 DNA 分子的连接能力有相当的不同。这导致了突变效率的变化，在这种方法中，效率变化的范围可以从 30%~70%。一旦发现一批质量好的酶，推荐将其保存起来专门用作 PCR-SDM。

(11) 在 37℃ 将反应物温育1h。

4. 转化感受态细胞（快速转化方案）

(12) 将热休克感受态细胞在冰上轻轻地解冻，然后取出 40ul 细胞到一个预冷的 FALCOL2059 聚丙烯管中。

(13) 向细胞中加入 1ul 连接酶处理过的 DNA，轻柔地搅拌，在冰上放置 30 min。

(14) 在 42℃ 热激 30s，然后在冰上放置 2 min。
已经针对 FALCON2059 管优化过热激的条件了，如果采用不同的管，反应条件应该重新做相应的优化。
如果使用的质粒包含有杀菌型抗生素抗性基因，在冰上放置 2 min 后，需要添加 260ul LB, 在 37℃、250r/min 的条件下摇动 30 min, 然后继续第 15 步操作。

(15) 立即将所有体积的感受态细胞放置到包含有适当选择性抗生素的 LB 琼脂平板上涂板。将平板在 37℃ 放置过夜。

如果在循环中使用矿物油覆盖在反应物上，那么在消化、拋光和连接过程中向反应管中加入附加组分的时候，一定要将微量移液器的尖端插入到矿物油层之下。

基因工程和蛋白质工程研究经常用到基因突变技术制备突变体，用于研究基因调控，表达和蛋白质的结构与功能。传统的用于研究蛋白质结构与功能关系的方法有两种：（1）对蛋白质一级结构的氨基酸残基侧链进行修改；（2）蛋白质晶体结构的X射线衍射。虽然这些方法能提供一定量的信息，但受到很多条件的制约，用途有限。如果采用定点突变技术在克隆DNA的预定位点导入突变，然后再适当的宿主细胞-载体系统中表达经改造的基因突变体，则可通过比较突变体蛋白与野生型蛋白的性质，鉴定出蛋白质的结构和生物学功能至关重要的结构域和个别氨基酸残基。由于定点突变及克隆化基因的表达两方面的发展，使得突变体研究成为生物化学家和分子生物学家分析蛋白质结构和功能的首选方案。

来源《 PCR 实验指南（第二版）》作者：种康，瞿礼嘉。