慢病毒包装实验

质粒 293T细胞

无血清培养基 脂质体 胰酶 含血清的培养基 DMEM

EP管 6孔板 CO2培养箱 高速离心机 -80°C冰箱

以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1x10⁶个293T细胞。

1. 取1.5ml灭菌EP管，加入1.5ug包装混合质粒和0.5ug表达质粒以及250ul的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。

2. 取1.5ml灭菌EP管，取9ul 脂质体2000l溶于250ul无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。

3. 将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min

4. 用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

5. 在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6. 将1ml重悬的293T细胞（1x10⁶个细胞/ml）加入到平板中。37℃ CO₂孵箱中孵育过夜。

7. 移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。

8. 转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀。

9. 病毒上清-80℃贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

1．慢病毒理论上可以包装5～7Kbp的片段，但过大的片段包装会影响病毒的出毒效率，导致获得的病毒滴度较低，影响病毒感染效果。因此一般建议最好将包装的片段控制在1.5Kbp以内。

2．病毒载体易突变和丢失，克隆过程中可能出现质

粒的包装信号突变或大小不等的片段丢失，导致无法成功包装出病毒。因此建议构建好含有目的基因的克隆载体(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先进行测序，以确保关键序列都正确无误。

3．包装细胞多选择为293T或293FT。要求细胞生长旺盛、状态良好，避免过密生长和体外传代次数过多。

4．转染时对质粒纯度要求较高，最好为去掉内毒素

的超螺旋质粒，以提高转染效率。多采用磷酸钙转染方法，既节约成本又可获得高的转染效率(一般可达到80％～95％)。

5．无论是三质粒或四质粒慢病毒系统，转染的各质

粒之间的比例非常重要，直接影响出毒效率。不同公司提供的质粒有所差别，因此无法一概而论，需要根据给出的比例进行调整优化。

6．转染前，细胞密度控制在50％～60％为佳。转染前4～8h换液，转染后不换液。转染第2天添加丁酸钠(TPA)可明显提高出毒率，之后8h再换液。每次换液前应将培养基预热至37℃，换液时动作轻柔以防细胞漂起。

7. 一般情况下，转染48h后收获得到的病毒颗粒最多，但也与当时细胞状态、生长速度和培养基pH值有关。收获病毒时培养基应呈红色，若过酸呈现黄色则会降低病毒收获率。

8. 不同厂家和批次的血清对病毒的产量影响很大，

需要筛选。

9．病毒液避免反复冻融，否则明显降低效率。

10．一般情况下，病毒液于-80℃中可保存1年，但建议半年之后重新检测病毒滴度。

构建慢病毒载体的过程比较复杂，自己构建既费时又费钱，一般情况下委托生物公司代为构建比较好。目前国内已有公司提供慢病毒的包装，研究人员只需将欲包装的基因序列号或碱基序列提供给公司，即可在2～3个月内拿到纯化好的3×10⁷—30×10⁷Tu的病毒颗粒，可直接用于细胞水平或动物体内实验，所有费用约为1.8万。

来源《肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册》，《细胞与分子生物学常用实验技术》。