慢病毒的浓缩与纯化

实验概要

本文介绍了慢病毒浓缩与纯化的两种方法：超速离心沉淀法，PEG-8000浓缩法。

实验材料

慢病毒上清液

实验步骤

超速离心沉淀法：
1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟；
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液；
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理；
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g；
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中；
6. 4℃，25，000 rpm，(82，700g) 离心2小时；
7. 小心将管子从转头中取出.倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干，吸掉剩余的液滴.在管底应当有可见的沉淀；
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀；
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子；
10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡；
11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底；
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬.避免产生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中；
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

PEG-8000浓缩法：
1. 5X PEG8000加NaCl配制称取NaCl 8.766 g；PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃；
2. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000加NaCl母液7.5 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80℃