成纤维细胞的分离

1) 胚胎的分离。

适用哺乳动物（仓鼠、小鼠和大鼠）

a. 采用认可的方案处死啮齿动物。

b. 立即在无菌超净台内用 70% 乙醇擦洗整个动物。若可能，置紫外灯下照射 5 分钟。

c. 用无菌的镊了和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宮，置于无菌的培荞皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS 的烧瓶中。

f. 漂洗胚胎，去掉 PBS。继续用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

适用鸡胚胎

a. 用 70% 乙醇擦洗鸡蛋壳。

b. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端，轻轻去除蛋壳露出气囊。

c. 用无菌摄子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜。

d. 剪开包膜，用弯镊夹住胚胎颈部取出胚胎。

e. 弃头部，将无头的胚胎置于广口烧杯中，用 PBS 漂洗。

2) 将 6~8 个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯屮，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎,

用 PBS 漂洗。

3) 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 500 ml 的无菌的有搅拌棒的烧杯中，加人

200~300 ml 用 HBSS 配制的 0.25％ 的无菌胰蛋白酶（CIBCO/BRL)。

4) 在温暖的环境中或置于 37°C 培养箱中轻轻搅动 15 分钟。

5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含冇悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中，该管内按照每 10 ml 上清加人 1 ml 牛血清的比例加人牛血淸以灭活胰蛋白酶。

6) 加人新鲜胰蛋白酶溶液（见前述步骤）于含有残留未消化组织块的 500 ml 烧杯中，重复步骤 4 和 5。

7) 离心混合的细胞悬液，1200r/min，5 分钟，弃上清。

8) 用新鲜的无菌 PBS 重悬沉淀的细胞，按步骤 7 再次离心。

9) 用 PBS 反复洗涤细胞至上清清亮为止。

即用含有 10% 牛血清和抗生素（如青霉素、链霉素）的 DMEM(CIBCO/BRL)10 ml 再悬沉淀，并使终体积为 100 ml。

11) 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。

可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。

12) 为确定现有细胞浓度，加人 0.2 ml 細胞悬液于 1.8 ml1% 醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数（见第 2 节中的"细胞计数")

13) 按每 10 mm 平皿 1x10⁷ 至 4x10⁷ 细胞的数量接种于 10 ml 组织培养液中，在饱和湿度的 C0₂ 培养箱中孵育直至细胞铺满。

14) 当细胞长满后，去除培养液，用 10% 的温暖的 Versene（用 PBS 配制的 0.53 mmol/L EDTA,GIBCO/BRL) 洗涤细胞层 2 次。

15) 弃 Versene，加人相同体积的温暖化 0.05% 胰蛋白酶-EDTA(GIBCO/BRL)

16)37°C 孵育 5 分钟

17) 用无菌吸管轻轻吹散细胞，并转移至一含 1~2 ml 牛血清的无菌管中。

18) 离心，1200/min,5 分钟，弃上清。

19) 再悬沉淀于 5 ml 培养液屮（见上文），另加人 15 ml 培养液，分装于 2 个 100 mm 平皿中。

20) 置 37°C 饱和湿度的 C0₂ 培养箱中培养细胞，直至细胞长满，继续步骤 14~20 以传代细胞。

注意事项

以此种方式培养的细胞传代许多次均生长良好，在前儿次传代后，仅成纤维样细胞可存活，可按第2节的方法进行细胞的冻存。