我国学者使用RNA模板首次在植物中实现同源重组修复

　　近日，中国农业科学院作物科学研究所作物转基因技术与应用创新团队与美国加州大学圣地亚哥分校合作,使用RNA作为同源重组修复（HDR）的模板，并分别利用核酶自切割和具有RNA/DNA双重切割能力的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，成功获得后代无转基因成分的抗ALS抑制剂类除草剂水稻植株。该研究是在植物中首次成功利用RNA作为同源重组修复模板，开辟了利用植物RNA作为同源供体模板进行同源修复的新思路，是植物基因组编辑领域的重大进展。相关研究成果“Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination”于2019年3月18日在线发表在《自然生物技术（ Nature Biotechnology ）》上。

　　自2012年CRISPR/Cas基因组编辑技术被发明以来，已被广泛应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组编辑。基因组编辑首先在基因组靶向位置产生DNA双链断裂（DSB），这些产生的DSB可通过非同源末端连接（NHEJ）或者HDR途径进行修复。NHEJ最常用于移码突变破坏基因功能，而HDR主要被用于对靶标序列的精准替换或定点插入。在多数物种中，NHEJ是DSB最主要的修复途径，而通过HDR途径进行精准修复的概率特别低。HDR修复途径需要额外提供同源重组的供体作为修复的模板，在动物中可以较容易地将CRISPR/Cas系统及同源重组供体递送入细胞中，而在植物中，主要通过农杆菌侵染或基因枪轰击愈伤的方式来进行CRISPR/Cas系统以及DNA供体的递送。虽然利用基因枪转化或者双生病毒系统可以提高DNA模板数量进而提高HDR的发生概率，但是实现高效率的植物同源重组依然是一个巨大的挑战，因此限制了基因组编辑的拓展应用。

　　研究人员首先利用分子生物学手段并对重组事件进行评估，证实了将RNA作为同源重组修复模板，参与CRISPR/Cpf1介导的DNA同源重组修复的可行性。与通常使用的DNA模板不同，RNA模板可以在体内通过植物自身的转录系统持续产生，为同源重组修复提供更多的模板。同时，选择具有RNA/DNA双重切割能力的CRISPR/Cpf1基因编辑系统，在细胞核内同时加工产生用于靶向目标序列的crRNA及一起转录的模板RNA，既产生了DSB又提供了同源重组修复的RNA模板，成功获得OsALS两个氨基酸定点替换成功的抗嘧啶羧酸类除草剂水稻植株，且在子代分离得到了定点替换成功且无外源转基因成分的植株。该项成果首次证明，除了通常使用的DNA模板，RNA同样可作为植物同源重组修复的模板。在此研究基础上，进一步优化该策略的效率，有望解决目前植物同源重组频率低下的难题，加速通过基因编辑技术，精准改良农作物重要农艺性状，进而定向创制农作物新种质的育种进程。

　　该研究得到转基因生物新品种培育重点项目、国家重点研发计划项目、中国农科院科技创新工程项目和“农科英才”领军人才项目的资助。