扫描电镜的基本结构和原理

扫描电镜成像方式与透射电镜不同，是用电视的方式成像。其基本要点是用极狭窄的电子束来扫描样品，即电子束在样品上作光栅运动。电子束与样品相互作用将会产生样品的二次电子发射，二次电子能产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序地建立起来的，即用逐点成像的方法获得放大的像。

　　一、基本结构                                                                

扫描电镜主要是由电子光学系统和显示单元组成，它是由电子枪、磁透镜、扫描线圈以及样品室组成。电子枪与透射电镜的电子枪基本相同，只是加速电压较低，一般在40kV以下。

磁透镜有第一、二聚光镜和物镜，其作用与透射电镜的聚光镜相同：缩小电子束的直径，把来自电子枪的约30μm大小的电子束经过第一、二聚光镜和物镜的作用，缩小成直径约为几十埃的狭窄电子束。

这是由于扫描电镜的分辨率主要取决于电子束的直径，所以要尽可能缩小它，为此，物镜还装备有物镜可动光栏和消散器。一个带有扫描电路的偏转线翻通以锯齿波的电流，产生的磁场作用于电子束使它在样品上扫描。

扫描电镜的真空系统也与透射电镜的真空系统相似，由机械泵、扩散泵、检测系统、管道及阀门等组成。样品室位于镜筒的底部。为了能观察大块样品，样品室是大于透射电镜的。与透射电镜一样，扫描电镜的镜筒也有一套合轴调整装置，但相对比较简单。

显示系统包括信号的收集、放大、处理、显示与记录部分。显示和记录部分包括两个显像管和照相机。一个显像管是长余辉的，用于观察;另一显像管是高分辨率的、短余辉的，用于照相。

　　二、成像原理

从电子枪灯丝发出的直径20～35μm的电子束，受到阳极的1～40kV高压的加速射向镜筒，并受到第一、二聚光镜 (或单一聚光镜)和物镜的会聚作用，缩小成直径约几十埃的狭窄电子束射到样品上。与此同时，偏转线圈使电子束在样品上作光栅状的扫描。

电子束与样品相互作用将产生多种信号，其中最重要的是二次电子。二次电子能量很低(小于50eV),受到闪烁片上的高压(＋10kV)的吸引和加速射向闪烁片。闪烁片受到二次电子的冲击把电子的动能转变成可见光，光通过光导棒送到光电倍增管，在那里光被高倍放大并转换成为电流。

这个电信号经过前置放大、视频放大后，用它去调制显像管的电子束强度。由于控制镜筒入射电子束的扫描线圈的电路同时也控制显像管的电子束在屏上的扫描，因此，两者是严格同步的，并且样品上被扫描的区域与显像管的屏是点点对应的。

在样品上任何一点上的二次电子发射的强度的任何变化将表现为在屏上对应点的亮度的变化，组成了像。可在观察显像管的屏上观察；也可把照相显像管屏上的像拍摄记录下来。

扫描电镜二次电子像的放大倍率由屏上图像的大小与电子束在样品上扫描区域的大小的比例决定：M=像的大小/扫描区域的大小。通常显像管屏的大小是固定的，例如多用9寸或12寸显像管，而电子束扫描区域大小很容易通过改变偏转线圈的交变电流的大小来控制。因此，扫描电镜的放大倍数很容易从几倍一直达到几十万倍，而且可以连续地迅速地改变，这相当于从放大镜到透射电镜的放大范围。

　　三、扫描电镜生物样品制备技术

大多数生物样品具有柔软且含有大量水分的特点，在行扫描电镜观察前，须对生物样品作相应的处理。由于样品性质不同，其处理方法和程序也不同。生物样品主要分两大类：

①含水量少且质硬的组织，如毛发等，样品一般含硅质、钙质、角质和纤维素等成分，通常只需经表面清洁、装台（粘胶）、导电处理等简单过程即可进行观察。如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

②含水分较多的软组织，如绝大多数的动植物器官、组织及细菌等。在金属镀膜前，须经固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像。

扫描电镜样品的处理过程：

主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程，基本上与透射电镜样品的处理方法相似,但也有其特殊之处。

1. 样品大小　所切取样品比透射电镜样品稍大一些，为8～10mm2，高约5mm。

2. 清洁表面　清洁表面并充分暴露样品表面。常用清洗液有蒸馏水、生理盐水、缓冲液及含酶的清洗液等。

3. 固定和脱水　常用的固定方法是戊二醛-四氧化饿双重固定，也可用戊二醛单固定法。

常用脱水剂是乙醇或丙酮。脱水剂浓度梯度增加，从30%或50%开始至100%进行脱水；易变形样品脱水剂浓度梯度宜缓慢递增。

4. 样品的干燥　脱水后，需要将样品中的脱水剂彻底挥发干净，即样品干燥。其方法有：空气干燥 、真空干燥、冷冻干燥和临界点干燥。

5. 样品表面导电处理　用金属镀膜法和组织导电处理技术，一是可增强导电能力，消除荷电效应；二是增加样品表面二次电子发射率，加强讯号，提高图像反差。

（1）金属镀膜：使样品表面覆盖薄层金属膜，这层薄膜与样品表面的凹凸形态完全一致，使标本表面的形貌得以反映。常用的金属有金、铂、钼、或金/铂、铂/铯合金。镀膜的方法有真空镀膜法和离子溅射法。

（2）组织导电技术：其目的是为提高导电率克服生物材料的荷电效应，提高样品表面二次电子发射率。组织导电处理也称导电染色，是利用某些金属盐类能与生物材料中的蛋白质、脂类和淀粉等结合，使样品表面离子化，使组织导电性增加；并且提高二次电子的发射率。可用醋酸铀、碘化钾、丹宁酸等处理标本。