抗原呈递细胞的选择和制备（一）

基本方案 过 利 斯 特 氏 菌 刺 激 制 备 腹 腔 巨 噬 细 胞

材 料

单核细胞增多性利斯特氏菌

无 菌 PBS

H -2 相 合 小 鼠（见 表 A .2A .1)，包括正常和提前 3 周注射了利斯特氏菌的小鼠

V冰浴的 D M E M 培养基

3 % (V A O 乙酸

0.4% (m /V ) 台盼蓝染液

V D M E M -1 0 完 全 培 养 基（室温以及 37°C )

7 0 % (V7 V ) 乙醇

IOml 和 30m l 的注射器以及 23 G 针头

离心机
9 6 孔培养板

移液器

显微镜

1 . 在 50m l 离心管内将利斯特氏菌用 P B S 稀释至合适浓度，此 时 0.5〜1.0m l 菌液中含半数致死量 5 % 〜1 0 % 的 细 菌（一 般 情 况 下 C B A /J 小 鼠 或 C 57B L / 6 小 鼠 需 IO⁵ 个细菌/m l ， B A L B /c 小鼠需 IO⁴ 个细菌/ml)。盖紧离心管盖后摇匀。用 IOml 注射器抽取稀释过的上清。

2 . 用 23 G 针 头 将 0.5〜1.0m l 细菌悬液注射人 H -2 相合小鼠腹腔。根 据 步 骤 6 计算出制备足够用细胞所需小鼠数量。

3.7〜Ild 后 收 集 腹 腔 细 胞（单 元 6.1)。用 冰 浴 的 D M E M 收集细胞以防止巨噬细胞黏附在管壁上。

4 . 将收集的细胞悬液置于 50m l 离心管， 4°C ， 400〜500 g 离 心 lOmin，收集细胞并重悬于 0.5m l 预 冷 的 D M E M 中。

5 . 吸取少量细胞悬液并以 1 : 5 (W F ) 悬 浮 于 3 % 的乙酸溶液中，以溶解红细胞。加入等量的台盼蓝染液并计数活细胞（见 附 录 3C ，细胞数量应达到 I X l O ⁷〜2 X 10⁷ 个
细胞/ml)。

6 . 在离心管内加入 D M E M -1 0 完全培养基，将细胞浓度调节至 2X 10⁶个细胞/m l 。如果血清浓度达不到 8 % 〜9 % ，可离心细胞弃上清后直接用 D M E M -I O 完全培养基稀释
至 2 X 10⁶ 个细胞/ml。将腹腔细胞转移至 9 6 孔培养板培养， IOUl/孔（2 X 10⁵个细胞/孔）。

7.37°C 培 养 2 h 或 稍 长 时 间（但不可过夜）以便巨噬细胞贴壁。

8 . 用多道移液器反复轻柔地吹打细胞，吸弃悬浮细胞后加入 37°C 预 热 的 D M E M -I O 完全培养基。注意操作宜轻柔且不能触碰到贴壁细胞。

9 . 在显微镜下检查细胞。分离的细胞若在 I d 内使用，就无需用 IFN-7 进一步活化。

备 选 方 案 1 连续注射利斯特氏菌和豚蛋白胨后制备腹腔巨噬细胞

此法可以较前法制备更多数量的小鼠腹腔巨噬细胞，但需要给小鼠多注射一次，且需要在更短的时间内收集巨噬细胞。此过程与前述基本方案基本相同，只是在初次注射细 菌 7〜IOd 后 ，直接给小鼠腹腔一次性注射 I m l 高压灭菌消毒的溶解于水的 1 0 % (V /V )豚蛋白胨。 3d 后如前述收集细胞（见基本方案，步 骤 3〜9)。

辅 助 方 案 1 小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制备

材 料

4 只 小 鼠（如 C B A /J)

培养单核细胞增生性利斯特氏菌（见 单 元 6. 6)

无 菌 PBS

I O O m m 无菌脑心浸液琼脂板

无菌脑心浸液培养基

细菌冻存液：溶 解 于 P B S 的 2 0 % (V /V ) 甘油，蒸汽消毒后 4°C 保存

70um 无菌尼龙滤网

50m l 离心管

无菌细菌涂布器

37°C 培养箱

无菌接种环

560n m 分光光度计

高速离心机以及无菌带盖离心管

Sorvall R C -5 离心机及 G S A 转子

I m l 冻存管

1 . 将适量利斯特氏菌注射至 2 只小鼠腹腔，以便通过体内途径获得利斯特氏菌并确保其毒力。如 对 于 C B A / J 小 鼠 ，可 使 用 IO6 个细菌/鼠。 2d 后处死小鼠，取出脾脏并制备脾细胞悬液，通 过 70 Mm 无菌尼龙滤网后将细胞置于 50m l 离心管。另 取 2 只小鼠作为对照。

也可以不通过体内传代，直接从脑心浸液琼脂板挑取利斯特氏菌克隆，参照步骤 3 接种至脑心浸液肉汤。

2.用 P B S 梯度稀释脾细胞悬液（1 : 10、 1 : 100、 1 : 1 0 0 0 ) 并 将 IOOm I 各组稀释细胞悬液分别置于 I O O m m 无菌脑心浸液琼脂板，用无菌细菌涂布器将细胞涂布均勻。置于 37°C 培养箱培养过夜。计数每块培养板的克隆数。确认涂布对照小鼠脾细胞板不形成克隆，且涂布实验小鼠脾细胞板形成大量克隆（对 于 1 : 1 0 0 稀释的细胞，每块培养板应获得 10〜100 个克隆）。

3 . 用接种环从培养板挑取 4 个 典 型 克 隆 并 分 别 转 移 至 20m l 无菌脑心浸液培养基中(50m l 离心管）。注意每次挑取克隆时接种环均需灭菌。加盖混匀。

4a. 制备当天细菌培养物：将 试 管 置 37°C 培养，每 30m i n 摇动一次。 3 h 后 ，定 时（比如每小时）取少量菌液通过分光光度计检测其 O D 值 。当 O D 值均达到 0.17 时停止培 养（约 需 4 h)，从中取一管再扩增。

4b. 制备隔夜细菌培养物：将 试 管 于 37°C 静 置 培 养 过 夜（试管盖无需盖紧）。第二 天 ，将试管内的菌液以 1 : 1000 稀释至无菌脑心浸液培养基，培 养 至 O D 值 达 到 0.5〜1.0 (约需 8 h)。

5 . 将菌液置 4°C 保 存（每 份 0.5 ml)。如方便，可于第二天确认培养物中是否含有利斯特氏菌。此外 ，利斯特氏菌能在 4°C 存活并扩增。对于隔夜培养的细菌，进 入 步 骤 7操作。

6 . 经过筛选后，将含有细菌的 15〜130m l 脑心浸液培养基转移至无菌高速离心管，将其固定在摇床的样品架上，在 37°C 缓慢摇动培养，定时检测 O D 56c 5 值 ，并 在 O D 56。值达 到 0.5〜L O 时 停 止 培 养（约 需 5 h)。

7.700g离 心 细 菌 6 min。在此过程需非常小心：因为培养物里含有大量细菌。将细菌悬 浮 于 IOml 冻存液中。

8 . 检测细菌的 O D 56。值（可 通 过 1 : 2 0 稀释后检测），将细菌的浓度调节至 I X l O⁷〜IO⁸个细菌/ml (O D 56。值 为 1 时细菌量约为 5 X 10⁸)。将 细 菌 分 装（0.1〜Iml) 保存于一80°C ，可以保存 3 年以上。每次解冻后使用，应避免反复冻融。