抗癌药物对ⅡDNA拓扑异构酶作用的实验

实验方法原理 DNA拓扑异构酶在DNA形成环状和超螺旋结构中起重要作用。另一方面在DNA超螺旋结构的松懈、DNA单、双链的断裂以至再连接的过程均有赖于该酶的参与，从而使DNA的复制或重组成为可能，关于抗癌药如烃化剂和非烃化剂，其中许多是以DNA拓扑异构酶为靶点使之形成可断裂的DNA蛋白复合物从而引起DNA损伤，这是近年来发展起来的一个新的研究领域。

实验材料 DNA

试剂、试剂盒 二甲基亚砜HepesKClEDTAMgCl2ATPBSAP4DNA聚乙二醇NaCl

仪器、耗材 电泳仪吸收度计恒温水浴锅恒温培养箱分光光度计离心机

实验步骤

一、材料准备

1.  药物制备

（1）将药物溶解于0. mol/l Hepes缓冲液或含10%~20%的二甲基亚砜中或其它助溶剂中。

（2）其它80%~90%为0.1 mol/l Hepes缓冲液，pH6.7，使药物的最终浓度为0.2~0.4 mmol/l。

2.  反应液

（1）反应液体积为24 ul

（2）其中包含500 mmol/l Hepes pH6.7，50 mmol/l KCl 100 mmol/l NaCl，0.1 mmol/l EDTA，10 mmol/l MgCl2，0.1 mmol/l ATP，50 ug/ml BSA，0.26ug P4DNA。

二、实验步骤

1.  实验将微量试管分组为

（1）加药管、不加药对照管，已知药（VP-16）对照管和标准管（含不同浓度的酶，根据所用酶的活性定出第一管的酶稀释度，然后依次成倍递减至第四管，第5管不含酶的空白管）。

（2）除空白对照管外将其与全部管中均加入酶液（浓度同标准管第一管的浓度）。

（3）放恒温水浴30 min 即刻用终止液停止反应（终止液：2%sodium dodecyl、20%甘油。0.05%溴酚蓝）。

2.  将以上各管的样本加到1%琼脂糖凝胶上在电泳缓冲液（90 mmol/l tris-boric acid pH8.3和2.5 mmol/l EDTA）中进行电泳，50V过夜。

3.  电泳终了将凝胶膜用溴乙啶染色（30~40 min），此时用紫外灯照射则DNA可显示荧光带。

4.  然后可用吸收度计进行定量测定或用荧光带的长度与个标准管进行对比，亦可获得半定量的结果。

5.  一个酶单位是指在30 min内可使50% 0.26ug超螺旋DNA转变为解旋转的DNA，每个测定是用两个酶单位。

6.  Ⅱ型DNA拓扑异构酶的分离制备

（1）人的Ⅱ型酶可用从白血病患者获得，例如慢性淋巴细胞白血病患者的外周白血病细胞中分离。

（2）将分离出的酶再用聚乙二醇纯化，再通过羟基磷灰石柱色谱、肝素-琼脂糖柱色谱和六氨基琼脂糖亲和色谱，使之纯化。

（3）用Coomassie蓝进行染色可见142 000、132 000和114 000 dalton三个区带。

7.  P4超螺旋DNA的制备