抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培养条件的优化及分批发酵研究

摘　要　Adenoregulin(ADR) 是来源于南美树蛙Phyllomedusa bicolor 皮肤的含有33 个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α-螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广的特点。将ADR 基因克隆于pET32a 载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3) ,对这一工程菌株的培养条件进行了优化。通过正交试验,考察诱导时机、诱导剂量和诱导时间三个因素的不同水平对蛋白表达的影响,结果发现诱导时机的影响尤为显著,考察了9 种不同培养基对表达量的影响,发现培养基中加入葡萄糖对目标蛋白的稳定表达起了重要的作用,确定最佳培养条件为:培养基为2 ×YT + 015 %葡萄糖,诱导时机为OD600 = 019 左右,诱导剂IPTG加入的终浓度为011mmolPL ,诱导时间为4h。采用前期恒pH、后期指数流加的策略进行工程菌BL21(DE3)PpET32a-adr 的高密度培养,在整个流加过程中,通过控制葡萄糖的加入量,将菌株的比生长速率控制在0115h - 1 ,乙酸浓度也被控制在较低的水平( < 2gPL) ,但是质粒丢失严重,在发酵结束时,约有40 %的大肠杆菌中不带质粒,这导致了目标蛋白的表达量下降严重,但是表达的目标蛋白90 %以上为可溶性形式。表达的融合蛋白无抑菌活性,而裂解后得到的ADR 单体具有明显的抑菌活性。