实验概要
本实验介绍了拟南芥原生质体制备转化操作流程。
主要试剂
1. 纤维素酶解液：
试剂 | 15ml酶液体系 | |
1 | 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) | 0.225g干粉 |
2 | 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) | 0.045g干粉 |
3 | 0.4M mannitol | 1.09g干粉 |
4 | 20mM KCl | 1 ml 0.3 M KCl母液 |
5 | 20mM MES,pH5.7 | 1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 |
6 | 加入10ml 水 | |
7 | 55℃水浴加热10分钟，冷却至室温后加入以下试剂 | |
8 | 10mM CaCl | 1 ml 0.15M CaCl2 |
9 | 0.1﹪ BSA | 1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存） |
10 | 5 mM β-Mercaptoethanol | 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液 |
11 | 用0.45μm滤膜过滤后使用 | 过滤 |
2. PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
PEG4000 | 1g |
水 | 0.75ml |
0.8 Mannitol | 0.625ml |
1 M CaCl2 | 0.25ml |
约1.2ml |
3. W5 溶液
W5（1000ml） | ||
154mM NaCl | NaCl | 9g |
125mM CaCl2 | CaCl2.H2O | 18.4g |
5mM KCl | KCl | 0.37g |
5 mM glucose | glucose | 0.9g |
0.03﹪ MES | MES | 0.3g |
pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 |
4. MMG溶液
MaMg溶液（500ml） | ||
15mM MgCl2 | MgCl | 0.71g |
0.1﹪MES | MES | 0.5g |
0.4 M mannitol | Mannitol | 36.5g |
用KOH调pH 5.6，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 |
5. WI溶液
WI(200ml) | ||
0.5M mannitol | mannitol | 18.217g |
4mM MES,pH5.7 | MES | 0.3g |
20mM KCl | KCl | 0.12g |
高温高压灭菌，室温保存。 |
实验步骤
1. 土培室播种种植拟南芥。
2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。
3. 剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。
4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
5. 用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。）
6. 在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液）
7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。
8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。
9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。
11. 在冰上静至原生质体30分钟。
以下操作在室温23℃下进行
12. 100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。
13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。
14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。
15. 加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。
16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。
17. 室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。
18. 室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
19. 用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。
20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。
21. 激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。
（以上实验可以根据自己实验情况适当调整）
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