揭秘口腔细菌Fretibacteriumfastidiosum的完整基因组序列助力牙周病研究

人类口腔微生物组由多种细菌组成。由于体外培养存在挑战，并非所有口腔细菌都被充分研究。在这项研究中，研究人员报告了一种最近发现的口腔细菌 —— 苛求弗雷特杆菌（Fretibacterium fastidiosum）的完整基因组序列。

口腔微生物组包含 700 多种细菌，其中超过三分之一尚未被培养出来。苛求弗雷特杆菌此前未被成功培养，它在肉汤培养中需要其他口腔细菌的刺激才能生长，并且可能与牙周病有关。为了进一步了解这种细菌与牙周病的关系，研究人员提供了苛求弗雷特杆菌 SGP1 的连续基因组序列。现有的参考菌株基因组（GenBank 登录号 GCA_000210715.1）由 362 个重叠群组成，含 9.95% 的未知碱基（Ns）。

苛求弗雷特杆菌 SGP1 从日本微生物菌种保藏中心（JCM:16858）获得，采用 Vartoukian 等人提出的方法并稍加修改进行培养。具体而言，首先将苛求弗雷特杆菌在与具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）ATCC 25586（来自 JCM:8532）交叉划线的血琼脂平板上培养以促进其生长。然后将菌落转移到添加了 1% 酵母提取物、0.1% L - 半胱氨酸盐酸盐水合物以及 50%（v/v）具核梭杆菌肉汤培养过滤上清液的 2 号营养肉汤中。接着通过离心收集 2×10⁹个细胞。使用 Maxwell RSC 培养细胞 DNA 试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市的 Promega 公司）和 Maxwell RSC 仪器提取 DNA，并利用 Tape Station（安捷伦）和 Qubit 荧光计（赛默飞世尔科技）评估 DNA 的质量和数量。按照制造商的方案，使用连接测序基因组 DNA - 本地条形码试剂盒 24 V14（SQK-NBD114.24；英国牛津的牛津纳米孔技术公司，ONT）制备测序文库，在清理步骤中使用长片段缓冲液。在 GridION（ONT）上使用一个 R10.4.1 流动池运行 19.5 小时，利用 Dorado v7.2.13 和模型 dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup@v4.2.0（ONT）进行碱基识别，得到 410,040 条原始读数，N₅₀为 6,365 bp。除非另有说明，所有程序均使用默认参数运行。

使用 cutadapt v4.8 进行接头修剪，设置 “-e 0.2 --trimmed-only”，5' 接头使用 “-g AAGGTTAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAGCACCT”，3' 接头使用 “-a AGGTGCTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTAACCTTAGCAAT”。利用 Flye v2.9.5 的元组装模式进行基因组组装，并使用 racon v1.5.0、minimap v2.26（设置参数 “-ax map-ont”）和 Medaka v2.0.1（设置 “-m r1041_e82_400bps_sup_v4.2.0”，ONT）进行抛光。使用 Berokka v0.2.3 修剪末端，使用 Circlator clean v1.5.5 去除重复序列，使用 Circlator fixstart 将序列调整为从 dnaA 起始。通过类型（菌株）基因组服务器（TYGS）和 BLASTN v2.16.1+（WebBLAST），使用核心核苷酸数据库进行系统发育分类。使用基准通用单拷贝直系同源基因（BUSCO）v5.6.1 的基因模式评估基因组完整性。使用 Prokka v1.14.6 进行基因注释，使用 D-Genies v1.5.0 创建点图。

苛求弗雷特杆菌 SGP1 和具核梭杆菌 ATCC 25586 的基因组均被环化组装，并且对于协同杆菌门（苛求弗雷特杆菌所属门类）或梭杆菌目（具核梭杆菌所属目）具有大量的 BUSCO 基因，表明它们是完整的基因组序列。相关统计数据列于表 1。图 1 展示了所报道的苛求弗雷特杆菌 SGP1 的基因组与同一菌株的有缺口参考基因组序列（GenBank 登录号 GCA_000210715.1）的比较。

研究人员感谢比勒费尔德大学组学 CF NGS 单位（在建）的下一代测序（NGS）团队以及 CeBiTec 技术平台基因组学的技术人员，特别是 Eva Schulte-Bernd、Yvonne Kutter 和 Katharina Hanuschka 的技术支持。研究还得到了比勒费尔德大学开放获取出版基金和德国研究基金会（DFG）对出版费用的支持。这项工作由德国生物信息学基础设施网络（de.NBI）中由德国联邦教育与研究部（BMBF）资助的 de.NBI 云支持，同时也由欧盟伊拉斯谟 + 计划 KA 171 项目 2024 共同资助。本研究是 Asuka Mori 提交给大阪大学的博士论文的一部分。

苛求弗雷特杆菌 JCM16858 由日本文部科学省国家生物资源项目的理化学研究所生物资源中心提供。作者感谢伦敦国王学院的 William Wade 教授允许使用该菌株。