断裂标记免疫电镜技术（1）

断裂-标记免疫电镜技术

此法是先进行冷冻断裂，再做免疫标记，从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。

(1)临界点干燥法

①固定:1.0%~2.5%戊二醛PBS液4℃1~2h，PBS冲洗3min×3。

如为细胞悬液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝胶化，将凝胶切成2mm左右的小块，用30%的甘油-PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却。

②冷冻断裂，将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中，培养皿放置于二氧化碳-液氮槽中，用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。

③解冻，置碎块于30%甘油-1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻。

④置换甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS冲洗，3min×2。

⑤免疫标记。

⑥1%锇酸，室温固定30min。

⑦系列梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷镀铂-碳膜，次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗，捞于有Formvar 膜铜网上透射电镜观察。