新载体大大提升哺乳动物细胞的蛋白产量

发布时间：2015-10-21 17:16 原文链接：新载体大大提升哺乳动物细胞的蛋白产量

　　科学家们用细胞系或细菌表达外源蛋白已经有三十多年历史了，这些技术已经在绝大多数实验室得到了普及。然而，像新药开发这样的应用需要大批量的蛋白，现有的表达体系难以胜任。日前研究人员在Nucleic Acids Research杂志上发表文章，展示了一类新型的重组蛋白表达载体。这种载体可以克服表观遗传学沉默，在哺乳动物细胞中表达大批量的重组蛋白。

　　重组蛋白的产量受到许多因素的影响，包括表达载体的类型，细胞系的质量、寿命和代谢等等。建立稳定的细胞系是表达目的蛋白最基本的第一步。不过除了细胞系和表达载体的属性，蛋白质产量也会受到表观遗传学的影响，这种影响取决于转基因在宿主细胞基因组上的整合位点。为此，有些质粒尝试使用容易形成开放性染色质的侧翼序列，还有一些质粒靶标宿主的常染色质热点区域。虽然第二条途径可以确保长时间的稳定表达，但只能整合一个拷贝的转基因，这无疑限制了转基因的表达。

　　为了最大化哺乳动物细胞的重组蛋白产量，Ludwig Boltzmann癌症研究所的Emilio Casanova和维也纳自然资源和生命科学大学的Renate Kunert决定使用细菌人工染色体（BAC）。（延伸阅读：Nature子刊：新技术给生物制药带来质的飞跃）

　　BAC载体

　　小鼠转基因领域的研究者们多年前就发现，基因组整合位点的染色质环境对质粒表达载体有很大的影响。如果载体整合到不太理想的位点，转基因就会受到沉默或者被忽略。为了克服这一问题他们开始使用较大的表达载体，比如BAC和酵母人工染色体（YAC）。这些大载体可以容纳整个基因座，囊括全部或大多数驱动基因表达的调控元件。“这些大载体整合到小鼠基因组之后不受周围染色质的影响，能够实现可靠而且拷贝数依赖的转基因表达，”Casanova说。“构建转基因小鼠和转基因细胞的原理是相通的，我们认为以BAC为基础的表达载体，可以成为建立重组蛋白生产细胞系的有力工具。”

　　研究人员将不同的开放性染色质区域、启动子和基因调控元件组合起来，生成了一系列BAC载体。随后他们在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中，测试了这些载体对重组蛋白表达的影响，包括人IgG1 Fc片段（IgG-Fc）、CN54gp140（一种高度糖基化的HIV-1蛋白）和PG9（一种中和性HIV-1抗体）。哺乳动物细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象，是生产重组蛋白药物的理想系统。而CHO细胞是目前基因工程制药中最常用的表达系统。

　　研究显示，在含有Rosa26基因座的BAC载体中，这三种蛋白都得到了持续而且稳定的高水平表达。“我们在CHO细胞中使用鼠源的Rosa26 BAC，结果蛋白质产量得到了显著提高，”Casanova说。“这种载体的重组蛋白表达水平非常高，只需要分析少量的CHO细胞（20–50）就能筛选到高产量的细胞克隆株。”

　　“我们将Rosa26 BAC与不同的强启动子结合，发现这些组合的表现并不一致。由此可见，启动子和染色质环境的组合是在CHO细胞中实现高水平转基因表达的关键，这也体现了染色质调控的复杂性，”他补充道。

　　研究人员指出，BAC通过增加基因转录来优化蛋白产量。如果蛋白表达的主要限制因素是翻译、折叠或分泌，那么BAC就不一定能有效提高蛋白质产量。此外，BAC的大小限制了它的转染效率，当然高蛋白产量和高比例表达细胞可以弥补这一问题。Rosa26 BAC还具有其它位点，可以表达进一步优化终产物的因子，比如糖基化酶或凋亡抑制子。

　　前景展望

　　CHO细胞的基因组含有大约一万个不重叠的BAC，虽然Rosa26 BAC已经获得了很好的效果，但研究人员还在继续筛选BAC表达载体，以便在哺乳动物细胞中更好的表达治疗性重组蛋白。他们对于在癌症和肝纤维化中靶标STAT3和STAT5特别感兴趣。

　　“我们的主要目标是使用新策略（比如BAC载体系统）开发表达重组蛋白的细胞系，”文章的共同通讯作者Kunert说。“分析最佳蛋白生产细胞的分子和生物学背景，将会推动治疗性蛋白的生产。将我们团队的技术知识与细胞生物学分析结合起来，对于基础科学转化为工业应用是很有帮助的。”