杂交和数据处理实验

Cy3－和 Cy5－标记的 cDNA 玻璃微阵列

DEPC处理的水 SDS SSC 酵母 tRNA Denhardt 溶液

热循环仪 65℃ 水浴 芯片杂交盒 图像分析软件

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 计算所需要的杂交液体积。

计算体积的经验是盖玻片所覆盖的每平方毫米载玻片面积需要 0.033 ul 杂交液。一个 24 mm×55 盖玻片需要 40 ul 杂交液。所加的杂交液应能足以产生无气泡的平整支撑面，这样盖玻片就与载玻片各处的距离一致。

2. 每个 40 的杂交体系中，将 Cy3 和 Cy5 标记的 cDNA 加入一个 0.2 ml 薄壁 PCR 管混合， 并加入 DEPC 处理过的水或用 Speedvac 蒸发仪除去一些水使它们的体积达到 30 ul。

3. 按下面所列组分配制每一份 40 的杂交体系：

芯片和样品会有某些差异，有时有必要对杂交液组分做适当调整。如果芯片上的重复 DNA 对照有残留的杂交信号，可以适当多加入入 C₀t－1 DNA，如高样品封闭。如果芯片上出现弥散的背景或所有的芯片元素上发生模糊，则需加入更多的非特异封闭组分，如高阵列封闭。

4. 吹吸使所有组分混匀，在热循环仪上 98℃ 加热 2 min，快速降温到 25℃，并加入 0.6 ul 10％ SDS。

5. 20～25℃ 16 000 g 离心 5 min，使凝聚的部分沉淀。

6. 把标记的 cDNA 小心地加到 24 mm×50 mm 盖玻片上，然后与倒转朝下的芯片相接触。

7. 把玻片放入一个芯片杂交盒。如果盒中有池，在池里加入 5 ml 3×SSC； 如果无池，加在玻片有标记的那一端。封好杂交盒。将盒子浸入 65℃ 水浴中杂交 16～20 h。

8. 从水浴中拿出杂交盒，冷却并仔细拭干，以免外面的水分在盒子打开时进到内部。打开杂交盒拿走玻片。

9. 将玻片和黏附在一起的盖玻片一起放入盛满 0.5×SSC/0.01％ SDS 洗液的 Coplin 缸内。此时盖玻片会从玻片上落下，用镊子捡去。玻片在缸子里洗 2～5 min。

10. 把玻片转入另一个盛满 0.06×SSC 的 Coplin 缸内洗 2～5 min。 根据 RNA 样品来源不同，洗涤的程序可能需要调整以更有效地去除噪声。第一步插入用 0.5×SSC/0.1％ SDS 洗涤或将常规的第一步洗涤重复一次都是有帮助的。

11. 将玻片转移到玻片架上，在带有可离心培养板的水平转子的临床离心机上低速离心（167 g 或 700～1000 r/min） 3 min。

根据所用型号和厂家不同，调节芯片显像设备的细节会有很大差别。同样地，许多方法都可以用于识别图像中的信号、调整背景水平，以及标化两个通道中的数值。这个部分只是想给出一些显像中整体考虑的原则。

12. 调节光电倍增器的电压和激光的功率使最强的信号只略低于读数上限［如果是 16 位（16－bit scale） 那么就是 65535］，而背景值（排布的点与点之间）一致略高于 0。然后收集整个图像的数值。

13. 将捕获的图像输入数据抽取软件。检査杂交的整体质量：注意一致性和背景水平、信号水平和分布情况、每个通道信号的相对强度以及大多数基因信号之间的可比性如何。

除非特别说明，所有溶液用无 RNA 酶的水（如 DEPC 处理过的水） 配制。

1. 材料

玻璃微阵列

Cy3－和 Cy5－标记的 cDNA

2. 试剂

DEPC处理的水

8 mg/ml poly（dA）40－60 （Amersham Pharmacia Biotech）

4 mg/ml 酵母 tRNA

10 mg/ml 人 C₀t－1 DNA

20×SSC

50×Denhardt 溶液

10％（m/V） SDS

0.5 × SSC/0.01 ％SDS 洗涤缓冲液

0.06×SSC 洗涤缓冲液

3. 耗材

0.2 ml 薄壁 PCR 管

热循环仪

24 mm×50 mm 玻璃盖玻片

芯片杂交盒

65℃ 水浴

芯片扫描仪

图像分析软件