实验材料 杆状病毒
试剂、试剂盒 胎牛血清重组病毒
仪器、耗材 培养箱培养瓶转子
实验步骤
从单层培养中制备:
1a.
以毎瓶1.8×107 Sf9细胞的密度,将细胞接种于两个150 cm2 培养瓶,在含10%胎牛血清的完全培养液中培养。于27℃让细胞贴壁3
h,然后移去完全培养液。以感染复数为0.1的病毒量,加入5 ml 含野生型或重组病毒的无血清完全培养液。于27℃温育1 h。
2a. 去掉病毒接种物,代之以20 ml 10%胎牛血清的完全培养液,于27℃温育1 h。每天在光学显微镜下检查细胞有无包涵体出现或细胞病变效应。
3a.
当大多数细胞含有包涵体或显示出细胞病变效应时(通常在感染后4至5天),收获病毒。将感染的培养物移入灭菌试管中,于4℃以1 000 g 离心10
min,将上清移至一新的灭菌试管,分别吸取1 ml 的小份上清移至几个螺口冻存管中,置液氮罐长期保存,将剩余的病毒毒种保存于4℃暗处。
从悬浮培养肀制备:
1b.
用50 ml 含10%胎牛血清的完全培养液在100 ml 旋转培养瓶中培养Sf9细胞,不停地振荡直到长至约2×106细胞/ml。于室温以1
000 g 离心10 min 回收细胞,弃去上清。以感染复数为0.1的病毒量,加入含野生型病毒或重组病毒的10~20 ml
无血清完全培养液重悬细胞团块。于室温培养1 h。
2b. 用含10%胎牛血清的完全培养液将体积加至100 ml 将细胞置于100 ml 旋转培养瓶中,于27℃培养3~4天,不停地振荡。
3b. 当大多数细胞含有包涵体或显示出细胞病变效应时,收获感染细胞,如步骤3a所述加以处理。
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