染色体提前凝集标本制备实验

HeLa细胞                                                          

PEG                                                                  Hanks液                                                                  RPMI-1640培养基                                                                  小牛血清                                                                  秋水仙素                                                                  KCl                                                                  柠檬酸钠溶液                                                                  次甲基兰染液                                                                  PBS                                                                  Carnoy固定液                                                                  Giemsa染液                                                          

显微镜                                                                  离心机                                                                  水浴箱                                                                  热吹风机                                                                  离心管                                                                  针头注射器                                                                  试管架                                                                  染色槽                                                                  载玻片                                                                  酒精灯                                                          

1.  收集培养的M期HeLa细胞取一瓶处于对数生长期的HeLa细胞。

2.  向培养基中加入10 μg/ml 的秋水仙素使终浓度为0.04 μg/ml，在37℃二氧化碳培养箱内继续培养12小时，使大量生长的细胞被阻断于M期。

3.  每组取一瓶经上述处理的细胞，以平行于细胞生长面方向反复振摇，使培养液不断冲涮细胞层（或用吸管吹打），M期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮。

4.  将含有M期细胞的培养基移入离心管中，1 000 rpm 离心5分钟，弃去上清加入5 ml Hanks液，用吸管吹打成细胞悬液。

5.  收集培养的HeLa细胞取一瓶生长良好的HeLa细胞，弃去培养基。

6.  加入少量0.25%的胰蛋白酶消化2~3分钟，弃去胰酶消化液。

7.  然后加入5 ml Hanks液，用吸管吹打成单个悬浮细胞备用。

8.  50%PEG的制备

（1）称取0.5 g PEG（MW4 000），倒入离心管中。

（2）在酒精灯上加热使之融化（约为0.5 ml）。

（3）再加入预热的Hanks液0.5 ml 混匀，放在37℃水浴中待用。

9.  细胞融合

（1）将上述1、2两管细胞倒入一个离心管中充分混匀。1 000 rpm 离心5分钟，去掉上清，再小心地吸尽残液。

（2）用指弹法弹散细胞，在37℃水浴条件下吸取0.5 ml 50%PEG，逐滴加入离心管内，并不断地轻轻摇动，整个过程约90秒钟。然后迅速加入5 ml Hanks液以终止PEG的作用。在37℃水浴甲静置5分钟。

（3）1 000 rpm 离心5分钟。弃去上清，加入2 ml 有血清的RPMI-1640培养基，同时用针头的注射器垂直加入10 μg/ml 的秋水仙素1滴，轻轻吹打成悬液，37℃水浴中温育30~60分钟。

10.  制备PCC标本

（1）细胞温育后，1 000 rpm 离心5分钟弃去上清，加入10 ml 0.075 mol/L KCl低渗液轻轻制成悬液。

（2）在37℃处理25分钟左右；终止时加入1 ml Carnoy固定液进行固定，1 000 rpm 离心8分钟，去掉上清。

（3）指弹离心管底部使细胞分散，加入10 ml Carnoy固定液固定30分钟。

（4）1 000 rpm 离心5分钟，弃去上清留0.2 ml，用吸管轻轻吹打成悬液。

（5）取预冷的载玻片滴一张片，烤干后，Giemsa染色15分钟左右，水冲洗，干燥后镜检。

11.  结果观察：在低倍镜下，可以容易地找到M期与I期细胞融合而诱导产生的PCC图像，由于处于I期不同时相的细胞均能与M期细胞融合而被诱导产生PCC，因此有三种不同形态特点的提前凝集染色体：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。

（1）形态特点分别是：

①G1期PCC为单线染色体，细长，着色浅呈蓬松的线团状；

②S期PCC由于染色体解旋，DNA以多点进行复制，复制后的部分着色较深，以双线染色体片段形式存在，故呈粉碎颖粒状结构；

③G2期PCC因DNA复制完毕，所以可见凝集的双线染色体，但较M期染色体细长。