染色体显微切割实验

RPMI1640完全培养基 秋水仙胺 固定液 Giemsa染液

倒置显微镜 玻璃针

一、显微切割中期染色体的制备

1.取0.5mL外周血与含PHA的4.5mLRPMI1640培养液混合，在37℃培养细胞64〜68h。

2.收获细胞前20min在培养基中加入25ml秋水仙胺（10μg/mL)，继续在37℃培养。

3.将细胞培养物移至15mL离心管中250g离心5min，然后小心弃上清。

4.用10mL低渗液重悬细胞沉淀，37℃水浴中温育12〜18min，250尽离心5min，弃上清。

5.用8mL新鲜配制的Camoy固定液轻柔地重悬细胞，将试管放置冰中至少2h，250g离心5min，然后小心弃上清。

6.用5mL固定液洗细胞2次，250g离心5min。

7.用0.5〜1.5mL固定液重悬细胞，获得有点不透明的悬液用于滴片。

8.滴2或3滴细胞悬液在干净的呈45°角倾斜的盖玻片上，随液体的流动铺匀整张片子，不要吹片子避免污染。

9.将片子在37℃无菌容器中可放置3〜5d备用。

10.在显微切割前完成用胰蛋白酶-Giemsa处理的标准G带。用胰蛋白酶工作液在室温中处理1〜2min/将片子移至室温条件下的Giemsa工作液5min，然后用蒸馏水漂洗片子，气干。

二、显微切割和拓扑异构酶I处理

1.在倒置显微镜下找到靶染色体，该显微镜有可随意转动的载物台，以使靶染色体垂直于玻璃针的移动轴。如果可能，显微镜应放在防震的台面上以减少振动。

2.用固定在显微镜上的显微操作装置控制的玻璃针切割靶染色体区域。

3.将玻璃针的针尖放置在靶DNA片段的正上方，然后向下移动玻璃针轻轻触及该片段。利用静电的力量将DNA片段吸到针尖，然后移动针尖到5μL收集液中。

4.在收集到预期数量（5拷贝）的切割DNA片段后，滴一滴矿物油覆盖在收集液上。在显微切割的DNA扩增前，用拓扑异构酶I 37℃处理1h使结构非常紧密的DNA解旋。

三、扩增切割的DNA

1.进行PCR启动程序（5〜8个循环，94℃、1min，30℃、2min，37℃、2min)，在每个循环的30℃时加入约0.3U的测序酶（13U/mL的测序酶用酶稀释缓冲液稀释1〜8倍，在5μL的反应体系中加入0.2PL测序酶稀释液)。

2.完成上述预扩增步骤后，在同一PCR管中进行Taq酶参与的常规PCR反应，PCR体系为50μL，PCR反应条件：94℃、1min，56℃、1min，72℃、1.5min的30循环，最后在72℃延伸5min。

3.加2μL第一轮PCR产物到另一个50μPCR反应体系中，进行20个PCR循环，反应条件同步骤2。

4.可用电泳分析识别处理的是否成功，将5μLPCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。PCR产物的大小范围应在200〜800bp。

四、荧光原位杂交

1.制备FISH探针，加2μL第二轮的PCR产物到与上述步骤相同的50μLPCR反应体系（除了加入终浓度为ZOμmol/L生物素-16-dUTP外）中，继续PCR反应20个循环:.94℃、1min，56℃、1min，72℃、2min，最后在72℃延伸5min。

2.按照产品说明的步骤用B10-gel P6过滤柱上离心PCR产物，以去除未掺入生物素-16- dUTP。

3.用1/10体积3mol/L乙酸钠和2倍体积乙醇在4℃沉淀探针20min。4℃条件下用10000g离心15min，用40μL TE缓冲液重悬探针。

4.FISH探针杂交是基于以前介绍的操作步骤基础上。简言之，对于每个杂交反应，大约100ng标记的探针混合于10μL杂交缓冲液（7μL杂交混合液、2μL探针和1μL人Cot1-DNA)中，在75℃变性5min，接着在37℃预杂交20min。

5.中期染色体标本需在72℃变性液中变性2min，然后将标本用70%、85%和100%的乙醇系列脱水。

6.将含有探针的杂交缓冲液滴在变性后的片子上，盖上22mmX22mm盖玻片，用橡皮胶封片。移至37℃湿盒中杂交过夜。

7.杂交完成后，移去盖玻片，将片子用45℃洗液I洗3次，每次5〜10min。

8.室温下用洗涤液II洗3次，用洗涤液III洗1次，每次2min。

9.只含有直接标记探针的杂交可在此时进行分析。用生物素标记探针的杂交，用40μL含5μg/mL FITC-亲和素的PNM缓冲液室温处理20min。然后按步骤8洗涤标本。

10.染色体标本经40斗含5μg/mL抗亲和素抗体的PNM缓冲液室温处理20min，将荧光信号放大；然后按步骤8洗涤标本。

11.染色体标本通常用另一层的FTTC-亲和素处理，处理条件同步骤9。

12.染色体标本经过70%、85%和100%乙醇系列脱水，空气中干燥。用40μL含DAPI(1μg/mL)的抗淬灭剂液复染，盖上盖玻片，用装有合适滤光片的荧光显微镜进行观察

1.用Camoy固定液固定细胞（甲醇：冰乙酸=3:1);用固定液保存1年内的细胞可获得高质量的FISH探针。

2.用于显微切割的中期染色体标本片龄最好为3〜14d;标本暴露于高温环境（>60℃)或存放时间过长可降低切割产物的质量。

3.玻璃针是用一个自动化的、弹簧负载的移液管成型器制备。针尖断点的直径与染色体的宽度一致，针要放在无菌的培养皿中保存，每次使用前要用紫外灯照射5min，确保消除DNA污染。