核提取物的制备实验

通过向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。对于特定的蛋白质，影响蛋白质盐析的主要因素：无机盐的种类、浓度、温度和PH值。

哺乳动物

PBS 低渗缓冲液 低盐缓冲液 透析缓冲液

转子 离心机 电导计 透析膜 匀浆机 离心管

1a.  收集转瓶培养的细胞：将浓度为5~10x10⁸细胞/l 的培养液用1 L 的塑料瓶1 850 g 离心20 min，将细胞收入50 ml 锥形离心管中（每管收2~3 L 培养液中的细胞）。进行步骤2。

1b.  收集单层培养的细胞：单层细胞长满后去掉培养液。用PBS洗1次。将细胞刮入新鲜PBS液里，倒进锥形离心管中。进行步骤2。

2.  1 850 g 离心10 min。

3a.  转瓶培养细胞：测量压紧后细胞的体积。将细胞重悬于约5倍于其pcv的PBS液中，1 850 g 离心10 min。进行步骤4。

3b.  单层培养细胞：测量pcv，进行步骤4。

4.  快速地将沉淀的细胞重悬于5倍体积的低渗缓冲液中，1 850 g 离心10 min。将细胞沉淀重悬于3倍于原pcv的低渗缓冲液中，放置在冰上10 min，让细胞肿胀。

5.  在Dounce氏玻璃匀浆器中用B号研杵缓馒上下抽提10次以上。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检査细胞裂解滑况（应大于80%~90%）。

6.  3 300 g 离心15 min，保留上清用来制备S-100细胞质提取物。

7.  测量第6步离心沉淀的压紧后的细胞核体积。用1/2 pnv体积的低盐缓冲液重悬细胞核（必要时用Dounce氏玻璃匀浆器匀浆一次）。

8.  在轻轻搅拌的同时，逐滴加入1/2 pnv体积的高盐缓冲液。终浓度应约为300 mmol/l。

9.  25 000 g 离心30 min，测量核提取物的电导率（用上请，见步骤10）。

10.  将核提取物加入透析管中，在50倍体积的透析液中进行透析，直到提取物的电导率和透析液一致为止（当提取物的KCl浓度达到100 mmol/l 时）。尽量缩短透析时间。

11.  将提取物从透析袋中移出45 000 g 离心20 min。

12.  用Bradford分析法测定上清中蛋白质的浓度。分装，浸入液氮中速冻，- 80℃保存。

所有步骤的操作均在0〜4℃进行，在冷室内操作更好。缓冲液和设备要预冷。所有离心均在4℃进行，转子要预冷。

细胞核提取方法的优化：

1.  按基本方案中歩骤1~7操作。

2.  将细胞核悬液分成5等份。在冷室内不断搅拌，按如下方法在每份悬液中加入1/3体积髙盐缓冲液，在第1份中加浓度最低（0.8 mol/l）的高盐缓冲液，其余各份中依次加入KCl浓度逐渐增髙（直到1.6 mol/l）的高盐缓冲液。轻轻混合30 min。