核蛋白提取实验

实验材料 水稻悬浮细胞

试剂、试剂盒 匀浆液裂解缓冲液SDS 样品缓冲液磷酸缓冲液

实验步骤

( 1 ) 按照 Morre 和 Anderson 的方法从水稻悬浮细胞中分离细胞核，本文对方法进行了一些改动。所有分离细胞核的步骤都在冰上或 4°C 进行。

( 2 ) 3000 g 离心 5 min 收集约 3 g 水稻悬浮细胞并重悬于 5 ml 冰浴预冷的 PBS 中。悬浮液再次用 3000 g 离 心 5 min。沉淀用 5 ml 匀浆液重悬后转移至玻璃研钵中并研磨成匀浆。

( 3 ) 匀浆用双层  Miracloth ( Calbiochem、Darmstadt、Germany) 过滤两次。

( 4 ) 转移匀浆至 15 ml  falcon 管中并用 1000 g 离心 10 min。

( 5 ) 轻轻地用匀浆液重悬沉淀并置于 2.0 mol/L 蔗糖梯度顶端，然后在 4°C 条件下 50000 g 离心 30 min。蔗糖梯度包含 37.5 mmol/L Tris-马来酸（pH 6.5 ) 、5 mmol/L MgCl2 和 1% 糊精 T500。

( 6 ) 小心地除去上清液，沉淀再次轻轻地用 5 ml 匀浆液重悬。

( 7 ) 再次将重悬液置于 2.0 mol/L 蔗糖梯度顶端并用 50000 g 离心 30 min。将含有细胞核的沉淀重悬于 100 μl 匀浆液中并用光学显微镜观察。（ 图 9-1A ) 。

( 8 ) 含有细胞核的悬浮液被用来提取核蛋白。可以用裂解缓冲液提取用于双向电泳的蛋白质样品，或用 SDS 样品缓冲液提取用于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质样品。每 20 μl 悬浮液中的细胞核可用 500 μl 裂解缓冲液或 SDS 样品缓冲液在玻璃匀浆机中溶解。

( 9 ) 核蛋白的纯度通过使用抗组蛋白 H1 抗体的 Western 杂交分析来检测（SantaCruz  Biotechnology， Santa  Cruz,  CA) (图 9-1B) 。

( 10 ) 利用双向电泳分离用裂解缓冲液从纯化后的细胞核中提取的蛋白质 ( 500 μg ) 。（图 9 - 2 , 见注释 1)。