核酸的电泳与检测

【实验目的】
（1）了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理，学会其具体的操作程序。
（2）对提取的DNA进行检测，掌握紫外电泳图谱的观察分析方法。
【实验原理】
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。带电荷的物质在电场中的定向运动称为电泳，核酸分子是两性解离分子，在pH8.0时，DNA分子带负电荷在电场中向正极移动。采用琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，长度不同的DNA分子由于受凝胶阻遏作用大小不一，迁移速度不同，从而达到有效分离DNA的目的。
【仪器、材料、试剂】
（一）仪器
1．电泳装置：电泳仪、水平电泳槽、梳子、制胶槽
2．紫外观察：凝胶成像系统
3．高速离心机
（二）材料
1．琼脂糖
2．三羟甲基氨基甲烷（Tris）
3．硼酸
4．乙二胺四乙酸（EDTA）
5．溴酚蓝
6．蔗糖
7．溴化乙锭（EB）
8．DNA Marker（λDNA）
9．称量纸、容量瓶、瓷盘、一次性手套、取液器、三角瓶、量筒（100mL）、Tip头（10uL）、胶带
（三）试剂配制[www.bbioo.com]
1．5×TBE（pH8.0）（电泳缓冲液） 1000 ml
配制方法：
称取Tris 54g、硼酸 27.5 g，再加入20ml的0.5mol/LEDTA加三蒸水定容至
1000ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。
2．凝胶加样缓冲液（6×）（指示剂） 100 ml
称取溴酚蓝0.25 g、蔗糖40 g然后加入三蒸水定容至100ml摇匀后，4℃保存备用。
【实验步骤】
（一）、制胶
1．称取0.4g（适量）琼脂糖置于三角瓶中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液。
2．微波炉加热，煮沸、振摇，反复加热、振摇2-3次，使琼脂糖充分融化。
3．胶带将胶床两端粘好，底部粘严，以防凝胶渗漏，插好梳子。
4．待胶冷却至60℃左右时，将融化的琼脂糖小心地倒入胶床中，速度要快，让 胶自然冷却至完全凝固（约需要20-30分钟）。
5． 小心向上方拔出梳子，避免前后左右摇晃，以防破坏胶面及加样孔，去掉制胶槽两边的胶带，小心将胶和胶床放入电泳槽中，样品孔在阴极端。
6． 向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，液面高于胶面约1-2mm。
（二）、上样电泳
1、取2μl上样液（溴酚蓝指示剂）于Parafilm上，加2μl水与2μl样品DNA反复吹吸，混匀。
2、Tip头垂直伸入液面下胶孔中，小心上样于孔中。
3、接通电源，打开高压开关，电泳开始以正、负极铂金丝有气泡出现为准。
4、根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。
5、凝胶取出后于含EB的溶液中染色20分钟。
（三）、凝胶紫外观察：
染色后的凝胶取出于紫外监测仪或凝胶成像系统中观察，照相，保存，记录结果。
【注意事项】【www.bbioo.com】
1. 琼脂糖融化时，档位不宜太高。
2. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。
3. EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。
4. 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或
DNA带型不整齐。
5. 电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。
6. 电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。
负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。
7． 溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。