核酸纯度、浓度与分子量测定实验

溴化乙锭是一种荧光染料，在凝胶电泳中，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出荧光，其强度与DNA量成正比。同时核酸最大吸收波长在260 nm，在此波长下，吸光度1 A相当于一定浓度的核酸，可以通过A260/A280 的比值，来测定所得核酸的纯度。

利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml），或已知浓度的DNA marker，和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳，以EB染色后，在凝胶图象分析仪上观察，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA 的含量。

比较DNA样品与DNA marker条带位置，推知DNA 样品分子量。

DNA

琼脂糖 TBE电泳缓冲液 TE buffer 溴化乙锭（EB） 载样缓冲液

电泳仪 电泳槽 电子天平 移液器 枪头 点样板 微波炉 紫外分光光度仪 凝胶图象分析仪

一、核酸的纯度测定

1.  将分光光度计打开，预热10分钟。

2.  将核酸溶液中取2 µl，加（或纯水）使体积成为100 µl。

3.  将稀释溶液加入石英管，以TE buffer（或纯水）为标准倒入另一管。

4.  在波长260、280 nm 处测定吸光值。

5.  比较在260 nm 及280 nm 之读值。

二、DNA含量和分子量的测定

1.  称取1.5 g 琼脂糖加入盛有100 ml 0.5×TBE电泳缓冲液三角瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。加入溴化乙锭（EB）至终浓度0.5 ug/ml，并摇匀。 

2.  用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固。 

3.  充分凝固后撕掉两端的胶布，垂直向上小心拔出梳子，以保证点样孔完好。凝胶置入电泳槽中，加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1~2 mm。

4.  用移液器吸取DNA样品8 μl 与 2 μl 的载样缓冲液混匀，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10 μl DNA Marker作为分子量标准。 

5.  打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到条带由负极向正极移动，约半小时后即可观察。 

6.  在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小；同时比较标准浓度及未知浓度的亮度，求取DNA 的含量。

1.  A₂₆₀/A₂₈₀>1.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值<<1.8，表示纯度低，这时由OD₂₆₀测得的DNA含量较不可信，核酸溶液中含有较多蛋白质，因此最好将前述所得核酸再重新抽取。

2.  EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。

测定260 nm 吸光值，OD=1.0代表值如下：

（1）ds DNA （double stranded DNA） = 50 mg/ml

（2）ss DNA （single stranded DNA or simgle-stranded RNA） = 40 mg/ml

（3）oligonucleotide = 33 mg/ml