根据引物合成单如何设定PCR退火温度？

• PCR退火温度应如何设置？

问题：引物单上数据如下

上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)

Tm(1M Na+)：68.2

Tm(50mM Na+)：46.6

下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)

Tm(1M Na+)：66.2

Tm(50mM Na+)：44.6

顺便问下大家，Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么区别啊?

回答：

TM值是在一定buffer盐浓度情况下计算出来的。你需要查一下你的PCR体系里buffer盐的浓度，然后找相应的TM值。不过TM值也是一个估算值，举个例子，以你的正向引物而说，TTACAAGATGGAGCCTCACC。在primer5计算得到TM是54.0， DNASTAR是49.1.所以这个数值仅供参考，最稳妥的做法是用梯度PCR仪  从55-65做一个梯度PCR。

PCR能不能做出来最关键的因素有两个，第一，模板质量如何，第二，引物3'是否有错配，gc含量如何。如果错配不严重的话，采用无脑梯度pcr的方法总能找到一个合适的退火温度  。