桥粒的制备

实验材料 牛口鼻部或舌头

试剂、试剂盒 柠檬酸缓冲液

仪器、耗材 匀浆器

实验步骤

1. 在当地屠宰场获取新鲜的牛口鼻部或舌头，立刻埋于碎冰中。

对于口鼻部：用剃刀刮掉口鼻部最外面的一层（角质层的角膜），收集下面的一层（棘层）。

对于舌头：从结缔组织的上面分解出表皮。

2. 用剪刀将解剖来的表皮剪成 0.5 cm X 0.5 cm 的碎片。用一个 Polytron 匀浆器匀浆表皮，每 10 g 组织加 200 ml 含 0.05% NP-40 的柠檬酸缓冲液。在 4℃ 搅拌匀浆物 1 小时。

柠檬酸缓冲液：

0.1 mol/L 柠樣酸（pH 2.6) ( 用 1 mol/L NaOH 调 pH 值）

0.1 mmol/L DTT

5 μg/ml 亮抑蛋白酶肽（Sigma）

5 μg/ml 抑胃酶肽

1 mmol/L PMSF

3. 用一块 50 μm 的尼龙网筛或网纱过滤匀浆物。

4. 滤过液用 13000 g 4℃ 离心 20 分钟。

5. 用含 0.01%  NP-40 的柠檬酸缓冲液重悬沉淀（每 10 g 表皮用 80 ml)。每间隔 10 秒超声 15 秒共超声 10 次，这将把桥粒与连接的细胞膜和其他细胞内成分分开。

6. 750 g 4℃ 离心 20 分钟。

7. 去掉沉淀，上清用 12000 g 4℃ 离心 20 分钟，沉淀包括由细胞碎片和细胞核组成的位于下面的灰色层和主要包括桥粒的位于上面的白色层。

8. 用含 0.01% NP-40 的柠檬酸缓冲液重悬上层的沉淀（每 10 g 表皮用 80 ml），12000 g 4℃ 离心 20 分钟。

9. 重复第 8 步两次，收集最终的沉淀。